Trong các dịch cơ thể, luôn có sự hiện diện các đoạn DNA có kích thước nhỏ khoảng 150 bp, chúng được gọi là DNA tự do (cf-DNA). Nguồn gốc của cf-DNA được cho là từ các tế bào bị chết do apoptosis, hoại tử (necrosis), … Vì các cf-DNA này vẫn giữ đặc điểm di truyền của loại tế bào ban đầu, các nhà khoa học sử dụng chúng như những dấu ấn sinh học (biomarker) tiềm năng để phát hiện và theo dõi các khiếm khuyết di truyền, chẳng hạn như bệnh ung thư hay bất thường di truyền ở thai nhi.

Các xét nghiệm sàng lọc trước sinh không xâm lấn (NIPT) nhận được sự quan tâm đầu tư của nhiều cơ sở y tế tư nhân trên khắp thế giới. Còn ở các xét nghiệm ung thư, cho đến hiện nay đã có 3 xét nghiệm kiểm soát ung thư dựa trên cf-DNA được FDA công nhận cho phép sử dụng làm xét nghiệm thường quy trong lâm sàng. Chính các biến số trước phân tích (pre-analytical variable) là rào cản lớn nhất khiến các ứng dụng xét nghiệm sử dụng cf-DNA vẫn chưa được công nhận.

Bài này sẽ đề cập đến các biến số phổ biến nhất ở giai đoạn tiền phân tích (pre-analytical) ảnh hưởng đến kết quả phân tích cf-DNA. Nội dung được đúc kết chủ yếu dựa trên nghiên cứu về ct-DNA (cf-DNA của khối u), tuy nhiên về bản chất thì các yếu tố này cũng phù hợp cho các nghiên cứu về các loại cf-DNA khác:

• 1) Bản chất loại mẫu
• 2) Dụng cụ thu mẫu
• 3) Bảo quản và xử lý mẫu
• 4) Tách chiết cf-DNA
• 5) Bảo quản cf-DNA

Bảo quản loại mẫu

“Loại mẫu nào sẽ phù hợp cho tách chiết cf-DNA?”. Nhiều nhà khoa học cho rằng các dịch cơ thể khác không phải máu sẽ chứa nhiều ct-DNA hơn vì những dịch này nằm gần khối u hơn. Hiểu đơn giản là các nhà khoa học tin rằng nước tiểu sẽ phù hợp cho ung thư bàng quang, nước bọt sẽ phù hợp cho ung thư vòm họng, …

Tuy nhiên nghiên cứu về cf-DNA thường tập trung vào mẫu máu vì đây là loại mẫu có tính đại diện cao, có thể sử dụng cho nhiều loại cf-DNA khác nhau. Rất nhiều nghiên cứu cũng đã được thực hiện để tìm ra thành phần nào trong máu sẽ phù hợp để tách chiết ct-DNA, là huyết tương (plasma) hay là huyết thanh (serum)?

Nghiên cứu chỉ ra hàm lượng cf-DNA trong huyết thanh cao hơn từ 3 ~ 24 lần so với cf-DNA trong huyết tương. Tuy nhiên cf-DNA trong huyết thanh đa phần là do tạp nhiễm DNA bộ gene (gDNA) do bước đông máu trong quy trình thu nhận huyết thanh. Trong khi đó, loại cf-DNA cần phân tích cần phải mang các đặc trưng khác biệt so với DNA bộ gene, chẳng hạn như cf-DNA từ khối u (ct-DNA) hoặc cf-DNA từ thai nhi (fetal cf-DNA).

Các nghiên cứu sâu hơn chỉ ra ở phụ nữ mang thai, cf-DNA từ thai nhi trong huyết tương cao gấp 20 lần so với huyết thanh. Tương tự, ct-DNA trong huyết tương cũng cao hơn so với huyết thanh từ 2 ~ 3.5 lần. Điều này cho thấy huyết tương (plasma) là nguồn mẫu phân tích cf-DNA phù hợp hơn so với huyết thanh (serum).

Dụng cụ thu mẫu

1) Loại ống thu nhận mẫu máu: Có rất nhiều loại ống thu mẫu máu khác nhau được thiết kế cho mục đích thu nhận cf-DNA, chất lượng của ống lấy máu sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến độ sạch, độ nguyên vẹn và hàm lượng cf-DNA thu nhận được. Trong quá khứ, ống EDTA được sử dụng để thu mẫu cf-DNA và được xem như tiêu chuẩn vàng do hoạt tính ức chế enzyme DNase của EDTA. Tuy nhiên ống EDTA đòi hỏi phải bảo quản lạnh và xử lý thu nhận huyết tương trong vòng 6 giờ, điều này tạo ra nhiều khó khăn trong nghiên cứu và ứng dụng, đặc biệt là khi phòng thí nghiệm nhận mẫu nằm ở rất xa địa điểm thu mẫu.

Từ đó, rất nhiều sản phẩm ống thu mẫu cf-DNA đã được phát triển với 2 mục đích chính là kéo dài thời gian tối đa trước khi xử lý thu nhận huyết tương và đơn giản hóa nhiệt độ bảo quản như bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc thậm chí chịu được nhiệt độ cao (37 ^oC). Do ảnh hưởng to lớn của ống thu nhận mẫu đến chất lượng cf-DNA nên nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để so sánh và đánh giá nhằm tìm ra loại ống thu nhận mẫu phù hợp.

Một nghiên cứu so sánh 4 dòng ống thu mẫu cf-DNA của Streck, PAXgene, Roche và Norgen cho thấy ống thu mẫu của Norgen thì tốt trong hiệu quả thu hồi cf-DNA, ống thu mẫu của Roche thì tốt về độ toàn vẹn và nồng độ, trong khi đó ống thu mẫu của Streck thì có dấu hiệu tan máu. Kích thước cf-DNA ở ống thu mẫu của Norgen vào khoảng 150 bp trong khi ở các ống thu mẫu khác là khoảng 160 – 180 bp, nguyên nhân của sự khác biệt này vẫn chưa được làm rõ.

Ngoài 4 dòng ống thu mẫu cf-DNA kể trên, nhiều loại ống thu mẫu cf-DNA mới cũng đã được giới thiệu ra thị trường, tuy nhiên các ống thu mẫu cf-DNA này cần có các nghiên cứu so sánh kiểm chứng thêm về mức độ phù hợp trong thu nhận cf-DNA.

2) Thể tích mẫu thu nhận: Đây là một vấn đề thường bị bỏ quên khi lựa chọn ống thu nhận cf-DNA, Nikolaev và cộng sự đã phát hiện ra rằng ống thu nhận của Roche nếu không thu đủ thể tích thì sẽ xảy ra tình trạng đông máu và tán huyết, tuy nhiên ở ống thu nhận của Streck thì không xảy ra tình trạng này. Thông thường thể tích huyết tương trong các ống thu nhận cf-DNA chiếm khoảng 40% tổng thể tích và càng để lâu thì lượng huyết tương thu hồi được càng ít đi. ParPart-Li và cộng sự đã thử nghiệm thu nhận huyết tương sau 7 ngày bảo quản, kết quả họ chỉ thu hồi được 2 mL huyết tương từ 10 mL mẫu máu đầu vào ban đầu. Một nhóm nghiên cứu khác cũng đã thử nghiệm bảo quản mẫu trong điều kiện khắc nghiệt (4 ^oC và 40 ^oC trong 5 ngày) và thể tích huyết tương thu hồi được chỉ còn khoảng 1 mL.

3) Sai số giữa các lô sản xuất: Đối với ống thu nhận cf-DNA, hiện tại chỉ có duy nhất 1 nghiên cứu thử nghiệm so sánh khác biệt giữa các lô sản xuất. Nghiên cứu này thử nghiệm 3 lô ống thu nhận của Streck và nhận thấy nồng độ cf-DNA không có khác biệt đáng kể giữa 3 lô sản xuất. Dù vậy, vẫn cần theo dõi sự thay đổi giữa các lô bằng cách luôn sử dụng một mẫu cf-DNA phù hợp để làm đối chứng (control) đánh giá sự biến động về chất lượng giữa các lô sản xuất.

Bảo quản và xử lý mẫu

1) Bảo quản mẫu máu thu nhận: Dựa trên các tài liệu nghiên cứu khi bảo quản ở nhiệt độ phòng, đối với ống EDTA thì nên thực hiện tách chiết huyết tương trong vòng 6 giờ kể từ thời điểm thu mẫu, còn đối với ống thu nhận cf-DNA thì nên thực hiện tách chiết huyết tương trong vòng tối đa 7 ~ 14 ngày kể từ thời điểm thu mẫu.

2) Xử lý tách chiết huyết tương: Nhiều bài báo đồng tình với giải pháp ly tâm 2 lần để tách chiết huyết tương, tuy nhiên về vận tốc ly tâm tối ưu trong tách chiết huyết tương vẫn chưa có con số thống nhất cụ thể tại thời điểm hiện tại.

• – Lần ly tâm đầu tiên nên sử dụng tốc độ thấp 800 ~ 1,600 G trong vòng 10 phút để tách các mảnh vụn trong huyết tương ra khỏi lớp màng đệm (buffy coat).
• – Lần ly tâm thứ hai nên sử dụng tốc độ cao 16,000 G trong 10 phút (hoặc 3,000 ~ 6,000 G trong 20 phút) để loại bỏ hoàn toàn các mảnh vụn tế bào.

3) Bảo quản huyết tương chứa cf-DNA: Phần lớn thời gian mẫu được lưu trữ ở dạng huyết tương đã tách chiết, vì vậy điều kiện bảo quản huyết tương cũng cần được quan tâm. Một nghiên cứu nổi bật cho thấy chất lượng cf-DNA thay đổi không đáng kể khi bảo quản huyết tương ở -80 ^oC trong 2 tuần. Một nghiên cứu chỉ ra lượng cf-DNA trong huyết tương sẽ giảm đi khoảng 30.7% sau mỗi năm nếu bảo quản huyết tương ở -80 ^oC trong thời gian dài.

4) Rã đông huyết tương chứa cf-DNA: Mặc dù có nhiều nghiên cứu liên quan đến việc đông lạnh – rã đông liên tục huyết tương sẽ làm giảm chất lượng cf-DNA. Hầu như không có nghiên cứu về điều kiện rã đông được thực hiện. Một nghiên cứu thực hiện trên dịch nuôi cấy tế bào cho thấy khi rã đông ở 37 ^oC sẽ làm tăng nhẹ lượng cf-DNA thu hồi được. Tuy nhiên, nguyên nhân lượng cf-DNA tăng lên vẫn chưa rõ và vẫn chưa có bất kỳ một nghiên cứu nào thực hiện trên mẫu huyết tương.

Tách chiết DNA tự do (cf-DNA)

Có ít nhất 40 loại kit tách chiết cf-DNA đang được sử dụng trên thị trường, trong đó có cả kit dành cho quy trình tách chiết thủ công (manual) lẫn tách chiết tự động (automated). Dù là quy trình nào thì thông thường cũng tách chiết cf-DNA dựa trên 1 trong 3 phương pháp cơ bản:

• Tách chiết cf-DNA bằng cột lọc
• Tách chiết cf-DNA bằng hạt từ
• Tách chiết cf-DNA bằng hóa chất

Vấn đề cần quan tâm ở kit tách chiết cf-DNA đó là cân nhắc giữa hiệu quả thu nhận, thời gian và mức độ chọn lọc để lựa ra phương pháp phù hợp nhất với quy trình nghiên cứu. Các quy trình tách chiết tự động thường có hiệu quả thu nhận không cao nên sẽ phù hợp với các nghiên cứu không đòi hỏi lượng cf-DNA thu nhận. Bên cạnh đó sự chọn lọc kích thước cf-DNA cũng là vấn đề cần quan tâm, ct-DNA thường có kích thước nhỏ hơn (<166 bp) so với cf-DNA từ các tế bào bình thường, vì vậy trong nghiên cứu về ung thư thì một bộ kit tối ưu cho thu nhận các trình tự cf-DNA kích thước nhỏ sẽ được quan tâm hơn.

Dù là như vậy, thật sự rất khó có thể so sánh thông qua tổng hợp các nghiên cứu khác nhau bởi vì mỗi nghiên cứu sử dụng một quy trình khác nhau, chưa kể một số phòng thí nghiệm còn hiệu chỉnh quy trình ở một số bước để phù hợp với nghiên cứu của họ. Vì vậy nếu chỉ dựa vào thông tin từ các nghiên cứu thì rất khó để so sánh, trừ trường hợp có so sánh trực tiếp giữa 2 bộ kit tách chiết cf-DNA.

Bảo quản mẫu DNA tự do (cf-DNA)

1) Thời gian và nhiệt độ bảo quản: Có 2 nhiệt độ bảo quản cf-DNA thường được sử dụng là -80^oC và -20^oC. Theo Sozzi và cộng sự, bảo quản cf-DNA ở -20^oC thì trung bình mỗi năm hàm lượng mẫu sẽ giảm đi khoảng 30%. Vì vậy nếu cf-DNA được sử dụng nhằm mục đích định lượng hoặc phân tích mức độ phân mảnh thì không nên bảo quản quá 3 tháng ở -20^oC. Trong trường hợp cf-DNA được sử dụng để phân tích các đột biến thì không nên bảo quản quá 9 tháng ở -20^oC hoặc -80^oC.

2) Đông lạnh – rã đông mẫu cf-DNA: Ngược lại với huyết tương, nồng độ cf-DNA không bị ảnh hưởng khi lặp lại việc đông lạnh – rã đông. Dù vậy, vẫn cần hạn chế số lần đông lạnh – rã đông để tránh phân mảnh cf-DNA.

3) Ống bảo quản mẫu cf-DNA: Nghiên cứu chỉ ra các loại ống bảo quản khác nhau sẽ ảnh hưởng lượng cf-DNA thu hồi sau khi bảo quản. Một số bài báo khuyến cáo nên sử dụng ống bảo quản bằng nhựa poly-propylene phiên bản “low-binding” để hạn chế cf-DNA bám lại bên trong ống. Bronkhorst và cộng sự đã thử kiểm chứng so sánh giữa ống eppendorf 1.5 mL thông thường với ống eppendorf 1.5 LoBind, kết quả thật bất ngờ khi ống LoBind lại thu hồi được ít cf-DNA hơn, điều này gợi ý rằng có thể thiết kế “low-binding” không thật sự chống được việc cf-DNA bám lại bên trong ống bảo quản.

Kết luận

Việc tối ưu các biến số trước khi phân tích (pre-analytical) là bước then chốt để tối ưu độ nhạy, độ đặc hiệu, độ tin cậy của kết quả phân tích cf-DNA. Trong đó có 5 yếu tố phổ biến thường dẫn đến sự không ổn định của phương pháp là: bản chất loại mẫu, dụng cụ thu mẫu, quá trình bảo quản và xử lý mẫu, quy trình tách chiết cf-DNA, quy trình bảo quản cf-DNA.

Quan tâm chưa đúng mức các biến số trước phân tích (pre-analytical) chính là nguyên do khiến cho quy trình kiểm soát chất lượng (QA) có phương sai rất lớn và khó được công nhận. Hy vọng các thông số được nêu ra trong bài viết sẽ giúp chúng ta hiểu rõ hơn về các vấn đề cần quan tâm để chuẩn hóa quy trình nghiên cứu có sử dụng cf-DNA như xét nghiệm kiểm soát ung thư hay xét nghiệm chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPT).

Sơn Phạm – Lược dịch và tổng hợp

Tài liệu tham khảo

Ungerer, V., Bronkhorst, A. J., & Holdenrieder, S. (2020). Preanalytical variables that affect the outcome of cell-free DNA measurements. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, 1-24.