Chi phí có lẽ là trở ngại lớn nhất của công nghệ giải trình tự tế bào đơn. Việc ra đời những nền tảng có thông lượng cao (high-throughput) như Chromium (10X Genomics) đã giúp chi phí giải trình tự tế bào đơn giảm đi đáng kể khi tính trên mỗi tế bào, vì những nền tảng này cho phép thực hiện giải trình tự lên đến hàng chục nghìn (~80,000) tế bào đơn trong 1 lần chạy.

Nền tảng Chromium chạy trên chip có 8 giếng, mỗi giếng nạp được 10,000 tế bào. Trong trường hợp mẫu cần phân tích chứa ít tế bào, nếu mỗi giếng chỉ thực hiện 1 mẫu thì sẽ không tận dụng được lợi thế “thông lượng cao” do Chromium mang lại. Cell Multiplexing (CellPlex) chính là chìa khóa để giải quyết vấn đề này.

CellPlex là gì?

CellPlex là thuật ngữ của 10X Genomics, dùng để chỉ công nghệ đánh dấu các mẫu đầu vào bằng trình tự gọi là CMO, sau đó gộp nhiều mẫu (pooling) lại với nhau để có thể chạy được cùng lúc nhiều mẫu trên 1 giếng tạo vi giọt (GEM-well). Sau khi giải trình tự tế bào đơn, có thể phân nhóm dữ liệu của các mẫu khác nhau thông qua trình tự CMO (Hình 1). Hiện tại (năm 2021), CellPlex chỉ có thể sử dụng trong quy trình giải trình tự đầu 3′ RNA tế bào đơn (Single-cell 3′ Gene Expression). Ngoài ra, việc sử dụng CellPlex không ảnh hưởng đến phân tích protein bề mặt tế bào đơn bằng công nghệ Feature Barcode.

Lợi ích của CellPlex

1) Tăng thông lượng mẫu: từ 1 mẫu/giếng thành 12 mẫu/giếng, tương đương 12 mẫu×8 giếng = 96 mẫu/lần chạy.

2) Tăng thông lượng tế bào lên 3 lần: từ 10,000 tế bào/giếng thành 30,000 tế bào/giếng

3) Tăng số lần lặp lại (replicate) có thể thực hiện

4) Dễ dàng phát hiện doublet/multiplet và loại chúng ra khỏi dữ liệu trước khi phân tích

Đánh dấu mẫu bằng CMO như thế nào?

Cell Multiplexing Oligo (CMO) là một dạng Feature Barcode đặc biệt (xem thêm TẠI ĐÂY), được sử dụng để đánh dấu mẫu trước khi đem gộp mẫu. CMO sử dụng đầu dò lipid, cho phép chúng có thể bám lên bất kỳ tế bào nào hiện diện trong mẫu, trên phân tử Lipid được gắn 1 đoạn DNA chứa 3 vùng trình tự: Read 2N, Feature Barcode và Capture Sequence 2 (Hình 2).

Trong đó:

1) Read 2N: Trình tự Nextera Read2 của Illumina dài 34bp, đóng vai trò là vị trí bám mồi (PCR handle) ở lần đọc thứ 2 trong công nghệ giải trình tự NGS của Illumina,.

2) Feature Barcode: Trình tự dài 15 nucleotide, được sử dụng để “đánh dấu” mẫu. Mỗi mẫu sẽ được đánh dấu bằng 1 trình tự Feature Barcode khác nhau, vì vậy từ trình tự Feature Barcode kết hợp với index có thể có thể phân nhóm dữ liệu của từng mẫu.

3) Capture Sequence 2: Trình tự giúp cho gel bead có thể bắt giữ CMO, từ đó thực hiện các bước gắn barcode (10X Barcode) và nhờ đó có thể chuẩn bị thư viện CMO cho tế bào đơn.

Quy trình thực hiện CellPlex

Có thể nói rằng quy trình CellPlex là một quy trình giải trình tự tế bào đơn (xem thêm TẠI ĐÂY) có sử dụng Feature Barcode. Vì vậy quy trình thực hiện không khác gì quy trình của công nghệ Feature Barcode (xem thêm TẠI ĐÂY), điểm khác biệt duy nhất đó là phân tử đầu dò là lipid thay vì kháng thể, kháng nguyên, sgRNA. Quy trình CellPlex có thể tóm tắt như sau:

1) Đánh dấu tế bào trong mẫu bằng CMO.

2) Gộp các mẫu đã đánh dấu CMO vào chung 01 ống nghiệm, tạo thành mẫu hỗn hợp

3) Thực hiện quy trình giải trình tự tế bào đơn có sử dụng Feature Barcode với các mẫu hỗn hợp

4) Phân nhóm dữ liệu (demultiplex) dựa trên Feature Barcode bằng phần mềm Cell Ranger 6.0 (10X Genomics)

Những lưu ý khi chuẩn bị mẫu tế bào được đánh dấu bằng CMO

Mẫu huyền phù tế bào đầu vào nên có tỷ lệ sống > 90% và nên gộp mẫu theo tỷ lệ 1:1

Nên tối ưu điều kiện ly tâm cho phù hợp với loại tế bào, nhằm hạn chế thất thoát mẫu trong bước đánh dấu tế bào bằng CMO

Kỹ thuật phân tách tế bào bằng hoạt hóa huỳnh quang (FACS) được khuyến khích sử dụng để loại bỏ RNA tự do và các tế bào chết. FACS có thể được sử dụng trước hoặc sau khi gộp mẫu (Hình 3).

Không nên bảo quản đông lạnh (cryopreservation) với các tế bào (hoặc nhân) sau khi đã đánh dấu bằng CMO

Tài liệu tham khảo

1) 10X Genomics (Website). What is cell multiplexing?

2) 10X Genomics (PDF). Chromium Next GEM Single Cell 3ʹ v3.1: Cell Multiplexing.

3) 10X Genomics (PDF). Cell Multiplexing Oligo Labeling for Single Cell RNA Sequencing Protocols.

4) 10X Genomics (PDF). Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits User Guide (v3.1 Chemistry Dual Index) with Feature Barcoding technology for Cell Multiplexing.