Công nghệ Feature Barcode là gì?

Feature Barcode là công nghệ cho phép thu thập thêm một số thông tin về protein bề mặt (cell-surface protein), độ đặc hiệu kháng nguyên (antigen specificity), và xáo trộn biểu hiện gene có liên quan đến CRISPR (CRISPR-mediated perturbation) của tế bào đơn (Hình 1). Hiện nay, Feature Barcode có thể được sử dụng trong 3 quy trình giải trình tự tế bào đơn khác nhau của 10X Genomics:

1) Single-cell 3′ Gene Expression: Quy trình phân tích biểu hiện gene của tế bào đơn thông qua giải trình tự đầu 3′ của mRNA.

2) Single-cell 5′ Gene Expression: Quy trình phân tích biểu hiện gene của tế bào đơn thông qua giải trình tự đầu 5′ của mRNA.

3) Single-cell VDJ Enriched: Biến thể của Single-cell 5′ Gene Expression, cho phép tập trung phân tích thụ thể miễn dịch của tế bào T (TCR) hoặc globulin miễn dịch của tế bào B (Ig).

Công nghệ Feature Barcode hoạt động như thế nào?

Nguyên lý hoạt động: Công nghệ Feature Barcode sử dụng các phân tử đóng vai trò như một đầu dò (kháng thể, kháng nguyên, RNA dẫn đường) để phát hiện các phân tử mục tiêu (protein bề mặt, MHC đặc hiệu, CRISPR). Trên phân tử đầu dò được gắn 1 đoạn oligonucleotide chứa 1 trình tự gọi là Feature Barcode, trình tự này đóng vai trò như một “căn cước công dân” của phân tử đầu dò. Đầu dò mang Feature Barcode sau khi bám lên phân tử mục tiêu sẽ được xem như là 1 phần của tế bào, thực hiện “giải trình tự tế bào đơn” có thể phát hiện được tế bào nào mang Feature Barcode, mang bao nhiêu loại Feature Barcode và thậm chí có thể định lượng số lượng của từng loại Feature Barcode hiện diện.

Ứng dụng của công nghệ Feature Barcode

1) Trong phân tích protein bề mặt tế bào đơn (Single-cell cell surface protein): Feature Barcode giúp phát hiện các marker protein bề mặt, từ đó giúp xác định chính xác kiểu hình của tế bào. Việc sử dụng kết hợp giải trình tự RNA tế bào đơn với Feature Barcode cho phép phân tích đồng thời biểu hiện gene ở mức RNA lẫn mức protein của cùng 1 tế bào, từ đó có thể đánh giá khác biệt biểu hiện giữa mRNA và protein trên tế bào đơn.

2) Trong phân tích độ đặc hiệu kháng nguyên tế bào đơn (Single-cell antigen specficity): Feature Barcode được gắn vào các phức hợp peptide-MHC dạng đa phân (multimer), nhằm tìm kiếm các tế bào T mang thụ thể TCR đặc hiệu cho kháng nguyên đang sử dụng.

3) Trong phân tích các xáo trộn biểu hiện gene có liên quan đến CRISPR (CRISPR-mediated perturbation): Sàng lọc CRISPR là phương pháp hiệu quả để xác định các cơ chế sinh học phức tạp như sự tăng sinh tế bào, sự tồn tại của tế bào và cơ chế kháng thuốc / kháng độc tố. Người ta có thể chuyển hàng chục, hàng trăm, hàng ngàn CRISPR vào trong 1 tế bào thông qua thư viện lentivirus, chủ yếu liên quan đến các ứng dụng knock-out, hoạt hóa, cắt và ức chế gene.

Phân tử đầu dò trong công nghệ Feature Barcode

Phân tử đầu dò (kháng thể, kháng nguyên, RNA dẫn đường) sẽ được gắn 1 đoạn DNA chứa 3 vùng trình tự: PCR handle (hay Read 2), Feature Barcode và Capture Sequence (Hình 1a). Trong đó:

1) PCR handle: Trình tự TrueSeq Read 2 (hoặc Nextera Read 2) hoàn chỉnh, có vai trò là vị trí bám mồi (PCR handle) ở lần đọc thứ 2 trong công nghệ giải trình tự NGS của Illumina,.

2) Feature Barcode: Trình tự dài 15 nucleotide, được sử dụng để “đánh dấu” kháng thể. Mỗi loại kháng thể được sử dụng sẽ được đánh dấu bằng 1 trình tự Feature Barcode khác nhau, vì vậy từ trình tự Feature Barcode hoàn toàn có thể suy ra loại kháng thể bám vào bề mặt của tế bào đang xét, từ đó phát hiện sự hiện diện của phân tử mục tiêu (protein bề mặt).

3) Capture Sequence: Trình tự giúp cho gel bead có thể bắt giữ đoạn DNA gắn trên kháng thể, từ đó thực hiện các bước gắn barcode (10X Barcode) và nhờ đó có thể chuẩn bị thư viện Feature Barcode cho tế bào đơn. Tùy vào loại gel bead sử dụng mà trình tự Capture Sequence sẽ được điều chỉnh cho phù hợp.

Quy trình chuẩn bị thư viện tế bào đơn có sử dụng Feature Barcode (Hình 2)

Nhìn chung, việc sử dụng Feature Barcode không làm thay đổi nhiều đến quy trình chuẩn bị thư viện tế bào đơn ngoài việc bổ sung 01 bước đánh dấu tế bào đầu vào bằng Feature Barcode thông qua các kháng thể (hoặc kháng nguyên / RNA dẫn đường). Bài viết này sẽ minh họa quy trình chuẩn bị thư viện giải trình tự đầu 3′ RNA tế bào đơn (Single-cell 3′ Gene Expression) có sử dụng Feature Barcode.

1) Đánh dấu tế bào trong mẫu bằng kháng thể mang Feature Barcode.

2) Tạo GEM chứa tế bào đơn bằng nền tảng Chromium

3) Gắn 10X Barcode lên cDNA và lên đoạn DNA mang Feature Barcode

4) Chuyển cDNA mang 10X Barcode và đoạn Feature Barcode mang 10X Barcode vào 2 ống nghiệm riêng biệt. Chuẩn bị song song thư viện Single-cell 3′ Gene Expression và thư viện Single-cell 3′ Cell Surface Protein.

Sau khi giải trình tự thư viện protein bề mặt tế bào đơn (Single-cell Cell Surface Protein), mỗi một đoạn đọc ta sẽ thu được các thông tin:

1) Index: Trình tự đại diện cho mẫu, các trình tự có index giống nhau thì có nguồn gốc từ cùng 1 mẫu.

2) 10X Barcode (10X BC hay Cell BC): Trình tự đại diện cho tế bào, các trình tự có 10X Barcode giống nhau thì có cùng nguồn gốc từ 1 tế bào.

3) Feature Barcode: Trình tự dùng để đánh dấu loại kháng thể đã sử dụng, giúp phát hiện sự hiện diện của protein bề mặt tương ứng.

4) UMI: Mỗi kháng thể mang Feature Barcode khi bám vào tế bào đơn sẽ được gắn 1 UMI riêng, vì vậy có thể đếm số kháng thể bám trên tế bào thông qua đếm UMI, từ đó suy ra được số lượng protein bề mặt tương ứng trên từng tế bào. Nhờ có UMI, việc định lượng biểu hiện protein bề mặt của từng tế bào không bị ảnh hưởng bởi các bước PCR trong quy trình.

Tài liệu tham khảo

1) 10X Genomics (PDF). Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits User Guide (v3.1 Chemistry) with Feature Barcoding technology for CRISPR Screening.

2) 10X Genomics (PDF). Chromium Single Cell 3′ Reagent Kits User Guide (v3.1 Chemistry) with Feature Barcoding technology for Cell Surface Protein.

2) 10X Genomics (PDF). Chromium Single Cell V(D)J Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry) with Feature Barcoding technology for Cell Surface Protein.

3) 10X Genomics (PDF). Explore Cellular Diversity, Cell by Cell.

4) 10X Genomics (PDF). The power of single cell partitioning, Chromium Brochure.