Định lượng chính xác lượng protein là một yếu tố then chốt trong nghiên cứu khoa học. Các phương pháp như xét nghiệm đo màu và phép đo UV quang phổ trực tiếp tại bước sóng 280nm (A280) đều có những ưu và nhược điểm riêng.

[foxtoc]

Trong đó, phương pháp A205 nổi bật nhờ vào tính ổn định và độ nhạy cao hơn, không bị ảnh hưởng bởi thành phần axit amin cụ thể. So sánh hiệu suất giữa NanoDrop One và thiết bị quang phổ UV-Vis cao cấp Evolution đã cho thấy NanoDrop One có khả năng cung cấp kết quả chính xác tương đương. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc lựa chọn hệ số hấp thụ mol thích hợp, đặc biệt đối với protein có chứa gốc tryptophan và tyrosine, để đảm bảo độ chính xác trong quá trình định lượng.

Tầm quan trọng của việc định lượng protein trong nghiên cứu

Trong nghiên cứu khoa học, định lượng protein chính xác là yếu tố cần thiết để hiểu rõ tổng hàm lượng protein trong mẫu thí nghiệm hoặc sản phẩm đã pha chế. Điều này không chỉ quan trọng cho bản thân nghiên cứu mà còn là nền tảng cho nhiều xét nghiệm khác, giúp tạo ra dữ liệu chính xác và đáng tin cậy. Hiện nay, có nhiều phương pháp định lượng protein như phương pháp tiếp cận trọng lượng, xét nghiệm đo màu, phép đo UV quang phổ trực tiếp (như A280) và phân tích axit amin. Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có điểm mạnh và điểm yếu, đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải lựa chọn kỹ lưỡng để đảm bảo độ chính xác của dữ liệu và độ phù hợp với ứng dụng cụ thể.

Xét nghiệm đo màu, chẳng hạn, phụ thuộc vào chuẩn tham chiếu bên ngoài và có thể dẫn đến sai số nếu có sự khác biệt về đặc tính hấp thụ giữa sản phẩm và chuẩn tham chiếu. Trong khi đó, phép đo UV quang phổ trực tiếp, đặc biệt là tại bước sóng 280 nm (A280), là một phương pháp phổ biến nhờ tính đơn giản, không yêu cầu thuốc thử và tiêu tốn ít mẫu.

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số giới hạn nhất định. Độ hấp thụ của protein tại bước sóng A280 phụ thuộc vào sự hiện diện của các axit amin thơm như tryptophan và tyrosine, dẫn đến sự biến thiên lớn giữa các loại protein khác nhau. Điều này có thể gây khó khăn trong việc định lượng chính xác nếu protein mục tiêu không chứa hoặc chứa rất ít các axit amin này. Ngược lại, phương pháp định lượng protein tại bước sóng 205nm (A205) nổi bật với nhiều ưu điểm hơn, như độ biến thiên ổn định giữa các loại protein cùng với độ nhạy cao. Hệ số tiêu biến A205 không phụ thuộc vào thành phần axit amin cụ thể và protein có độ hấp thụ mol cao ở 205 nm, làm cho phương pháp này chính xác hơn và đáng tin cậy hơn trong nhiều trường hợp.

Khi thu thập dữ liệu A205 bằng các phương pháp trước đây, chúng ta thường phải đối mặt với các yếu tố thách thức sau:

• Hiệu suất ánh sáng tán xạ của các máy quang phổ: Ánh sáng tán xạ là hiện tượng ánh sáng bị lệch khỏi đường đi ban đầu khi tương tác với các hạt hoặc do đặc tính quang học của máy quang phổ. Khi máy quang phổ có hiệu suất ánh sáng tán xạ cao, kết quả đo lường có thể bị sai lệch. Do đó, hiệu suất ánh sáng tán xạ thấp là một đặc tính cần có ở một máy quang phổ
• Khả năng duy trì độ chính xác trong việc đo lường ánh sáng tại các bước sóng cực ngắn trong vùng tử ngoại (UV sâu): Vùng UV sâu đề cập đến bước sóng rất ngắn, thường dưới 220 nm, trong phổ tử ngoại. Đo lường chính xác trong vùng đòi hỏi thiết bị phải giữ được tính tuyến tính giữa cường độ ánh sáng hấp thụ và nồng độ chất phân tích. Bất kỳ sự sai lệch nào trong tính tuyến tính cũng có thể dẫn đến kết quả không chính xác.
• Các dung dịch đệm protein chứa các thành phần hấp thụ UV: khả năng hấp thụ ánh sáng UV của dung dịch đệm protein có thể gây nhiễu, làm ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả đo lường ánh sáng UV, đặc biệt tại bước sóng A205.

Tuy nhiên, những khó khăn này đã được giải quyết khi NanoDrop One với công nghệ độc quyền cho hiệu suất ánh sáng tán xạ thấp, giúp đơn giản hóa việc định lượng protein bằng phương pháp A205 với độ chính xác cao.

Hệ số hấp thụ mol A205 cho các phép đo peptide và protein

Ứng dụng Protein A205 trên NanoDrop One cho phép người dùng lựa chọn từ ba tùy chọn khác nhau (Hình 2). Tùy chọn được chọn sẽ tự động xác định hệ số hấp thụ mol (ε₂₀₅) để tính toán nồng độ protein dựa trên độ hấp thụ của mẫu tại bước sóng 205nm.

• Phương pháp ε₂₀₅=31
• Phương pháp Scopes
• Phương pháp tùy chỉnh ε₂₀₅1mg/mL

Các nghiên cứu trước đây cho thấy hầu hết các dung dịch protein ở nồng độ 1 mg/mL có hệ số hấp thụ mol (ε₂₀₅1mg/mL) dao động từ 30 đến 35². Hệ số ε₂₀₅ bằng 31 mL mg⁻¹ cm⁻¹ thường được sử dụng cho các peptide không chứa các gốc tryptophan và tyrosine¹.

Phương pháp Scopes cho một hệ số ε₂₀₅ chính xác hơn, đặc biệt là đối với các protein chứa một lượng đáng kể các gốc tryptophan (Trp) và tyrosine (Tyr). Độ chính xác tăng lên của phương pháp này tính đến sự hấp thụ đáng kể ở bước sóng 205nm do amino acid thơm của Trp và Tyr. Phương pháp Scopes sử dụng tỷ lệ A280/A205 trong phương trình để điều chỉnh cho sự hấp thụ của các nhóm thế Trp và Tyr³. Phương pháp này được phát triển bởi nhà nghiên cứu Robert Scopes, người đã tiên phong trong việc sử dụng hệ số hấp thụ mol ở 205 nm để định lượng protein, đặc biệt khi protein có chứa các amino acid thơm, giúp cải thiện độ chính xác của phép đo khi các gốc amino acid này có ảnh hưởng đáng kể đến kết quả.

Gần đây, Anthis và Clore đã đề xuất sử dụng phương pháp tính toán ε₂₀₅ dựa trên trình tự đặc trưng (ví dụ: phương pháp tùy chỉnh/Khác), phù hợp cho nhiều loại protein và peptide¹. Phương pháp này thích hợp cho các chế phẩm protein hoặc peptide tinh khiết có trình tự axit amin đã biết.

Hiệu suất A205 trên thiết bị NanoDrop One

Một thí nghiệm được thực hiện nhằm so sánh kết quả đo nồng độ của polymyxin giữa hai thiết bị đo quang phổ UV-Vis khác nhau: NanoDrop One và Thermo Scientific™ Evolution™. Polymyxin là một loại kháng sinh có cấu trúc peptide nhưng không chứa các gốc amino acid tryptophan (Trp) hoặc tyrosine (Tyr), điều này khiến việc đo lường nồng độ của nó trở nên đặc biệt vì các phương pháp đo thông thường (dựa vào sự hấp thụ tại bước sóng 280 nm, chủ yếu của Trp và Tyr) không thể áp dụng.

Mục tiêu của thí nghiệm

So sánh tính chính xác và độ nhất quán của hai thiết bị khi đo nồng độ của polymyxin trong dung dịch đệm Brij® 35 0.01%.

Quá trình thực hiện

1. Chuẩn bị mẫu: Polymyxin được pha chế trong dung dịch đệm Brij® 35 0.01% để đảm bảo rằng kết quả đo nằm trong phạm vi tuyến tính của thiết bị quang phổ Evolution, mẫu polymyxin được pha loãng thêm trong cùng dung dịch đệm.
2. Đo trên NanoDrop One: Lấy 2 µL mẫu polymyxin và nhỏ trực tiếp lên bệ mẫu của NanoDrop One.
3. Đo trên Evolution UV-Vis: Mẫu polymyxin được đưa vào cuvet thạch anh 10mm với thể tích mẫu lớn hơn và đo bằng thiết bị quang phổ Evolution.
4. Phân tích dữ liệu: 

•  Dữ liệu nồng độ của polymyxin thu được từ cả hai thiết bị được so sánh bằng cách vẽ đồ thị (Hình 3) và phân tích đường hồi quy.
•  Đường hồi quy này cho thấy kết quả đo nồng độ của polymyxin từ NanoDrop One tương đương với kết quả từ thiết bị Evolution, chứng tỏ rằng NanoDrop One có thể cung cấp kết quả chính xác và đáng tin cậy tương tự như một thiết bị quang phổ UV-Vis cao cấp.

Kết luận

Dữ liệu nồng độ polymyxin thu được trên cả hai thiết bị (Bảng 1) được vẽ đồ thị (Hình 3). Thí nghiệm cho thấy rằng NanoDrop One, dù chỉ sử dụng một lượng mẫu rất nhỏ, vẫn có thể cung cấp kết quả chính xác, tương tự như một thiết bị quang phổ UV-Vis truyền thống với cuvet. Điều này đặc biệt hữu ích trong các trường hợp cần đo mẫu có dung lượng rất nhỏ hoặc khi thiết bị truyền thống không tiện lợi.

Ngoài ra, để đánh giá ảnh hưởng của hệ số hấp thụ mol được sử dụng ở bước sóng 205nm (Scopes và ε₂₀₅=31) đến kết quả đọc, ba loại proteins với các tỉ lệ axit amin thơm khác nhau, bao gồm bovine serum albumin (BSA, 3 Trp và 21 Tyr), lysozyme (6 Trp và 3 Tyr) và polymyxin (không chứa Trp, Tyr), được pha loãng thành các nồng độ khác nhau. Dung dịch được chuẩn bị sau đó được đem đi đo với máy NanoDrop One với ε₂₀₅=31 và phương pháp Scopes (Bảng 2)

Nồng độ xác định được trong bảng 2 cho thấy kết quả giữa hai phương pháp  ε₂₀₅=31 và Scope chỉ cho thấy sự ổn định khi protein chứa ít tỉ lệ Tryptophan. Ngoài ra, hãng cũng nhấn mạnh khuyến cáo nên kiểm tra kĩ xem buffer của protein có hấp thụ ở bước sóng 205nm và gây nhiễu đến kết quả đọc hay không.

Tóm tắt 

Đánh giá hiệu suất tại bước sóng 205 nm (A205)

Máy đo quang phổ NanoDrop One tại A205 cho thấy kết quả đo nồng độ polymyxin tương đương với máy đo quang phổ Evolution.  → NanoDrop One có hiệu suất đáng tin cậy tại bước sóng 205nm, phù hợp cho các thí nghiệm cần độ chính xác cao với điều kiện tán xạ thấp của máy quang phổ.

Độ nhất quán trong kết quả (Bảng 1)

Kết quả của NanoDrop One ở bước sóng 205nm cho thấy độ nhất quán cao giữa các lần đo lặp lại, với độ lệch chuẩn dưới 0.04A.  → Khẳng định khả năng tái lập và tính ổn định của thiết bị trong các phép đo lặp lại.

So sánh các thiết bị (Hình 3)

Kết quả đọc từ NanoDrop One và Evolution cho thấy sự tương đồng.  → NanoDrop One có thể sử dụng thay thế cho Evolution trong các phép đo tại bước sóng 205nm mà không ảnh hưởng đến tính chính xác.

Ảnh hưởng của các gốc tryptophan và tyrosine lên nồng độ tính toán (Bảng 2)

Số lượng gốc tryptophan và tyrosine có ảnh hưởng đáng kể đến nồng độ tính toán tại bước sóng 205nm, đặc biệt khi áp dụng phương pháp Scopes. Phương pháp này sử dụng tỷ lệ A280/A205 để điều chỉnh cho sự hấp thụ của các gốc axit amin thơm.  → Cải thiện tính chính xác của kết quả tính toán nồng độ.

Nguồn tham khảo

1. Anthis, NJ and Clore, GM 2013. Sequence-specific determination of protein and peptide concentrations by absorbance at 205 nm. Protein Science 22:851-858. 
2. Goldfarb, AR, Saidel, LJ, Mosovich E 1951. The ultraviolet absorption spectra of proteins. Journal of Biological Chemistry 193(1):397-404. 
3. Scopes, RK 1974. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry 59:277-282.
4. Thermo Fisher Scientific (2024). Quantify protein and peptide preparations at 205 nm NanoDrop One Spectrophotometer