NanoDrop là một thiết bị quan trọng và không thể thiếu trong bất kỳ phòng thí nghiệm phân tích hoặc nghiên cứu nào. Chỉ với 1 μL mẫu, bạn có thể xác định cả nồng độ và độ tinh sạch của mẫu mà không cần tốn quá nhiều thời gian, vật tư hay hóa chất cho bước chuẩn bị. Vậy các chỉ số và hình ảnh tín hiệu mà NanoDrop cung cấp có ý nghĩa gì và cách sử dụng chúng như thế nào? Hãy cùng tìm hiểu qua bài viết sau đây.

[foxtoc]

Cơ Sở của Quang Phổ: Định Luật Beer-Lambert? Ý Nghĩa của Nó Là Gì?

A = ɛ.c.l

Trong đó A = độ hấp thụ, ԑ = hệ số hấp thụ, c = nồng độ và l = chiều dài đường đi của ánh sáng.

Định luật Beer-Lambert mô tả mối quan hệ trực tiếp giữa độ hấp thụ và nồng độ. Mặc dù các axit nucleic hấp thụ ánh sáng ở nhiều bước sóng khác nhau, nhưng chúng có đỉnh hấp thụ ánh sáng UV tại 260 nm. Do đó, lượng ánh sáng hấp thụ tại vùng này có thể được sử dụng để xác định nồng độ RNA hoặc DNA trong dung dịch bằng cách áp dụng định luật Beer-Lambert.

Độ Hấp Thụ Ở Các Bước Sóng

Bước Sóng 260 nm

Các axit nucleic hấp thụ ánh sáng UV ở 260 nm nhờ vào các nhóm bazơ thơm trong cấu trúc của chúng. Các purine (adenine và guanine) và pyrimidine (thymine, cytosine và uracil) đều có đỉnh hấp thụ tại 260 nm, vì vậy đây là tiêu chuẩn để định lượng các mẫu axit nucleic.

Bước Sóng 280 nm

Độ hấp thụ ở 280 nm được đo vì đây là nơi mà các protein và hợp chất phenolic thường có độ hấp thụ mạnh. Các chuỗi bên của amino acid thơm (tryptophan, phenylalanine, tyrosine và histidine) trong protein chịu trách nhiệm cho độ hấp thụ này.

Bước Sóng 230 nm

Nhiều hợp chất hữu cơ có độ hấp thụ mạnh ở khoảng 225 nm. Ngoài phenol, TRIzol và các muối chaotropic, các liên kết peptide trong protein cũng hấp thụ ánh sáng trong khoảng 200 đến 230 nm.

Tỷ lệ hấp thụ ở các bước sóng

Tỷ Lệ A260/A280

Tỷ lệ A260/A280 thường được sử dụng để xác định sự  nhiễm protein của một mẫu axit nucleic. Các protein thơm có độ hấp thụ UV mạnh ở 280 nm. Đối với RNA và DNA tinh khiết, tỷ lệ A260/A280 nên khoảng 2.1 và 1.8, tương ứng. Tỷ lệ thấp hơn cho thấy mẫu có thể bị nhiễm protein, điều này có thể ảnh hưởng đến các ứng dụng hạ nguồn của mẫu axit nucleic.

Tỷ Lệ A260/A230

Tỷ lệ A260/A230 là một chỉ số nhạy cảm để phát hiện các chất tạp nhiễm hấp thụ tại 230 nm. Các chất tạp nhiễm này bao gồm các muối chaotropic như guanidine thiocyanate (GTC) và guanidine hydrochloride (GuHCl), EDTA, chất tẩy rửa không phân cực như Triton™ X-100 và Tween® 20, cũng như phenol. Sự hiện diện của các chất này có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

Hình ảnh đường tín hiệu

Đây là hình ảnh một đường tín hiệu khi đo mẫu RNA đạt tiêu chuẩn tinh sạch và sẵn sàng cho các quy trình ứng dụng tiếp theo.

Mẫu RNA dưới đây có tỷ lệ A260/280 tốt, cho thấy không có sự hiện diện của tạp nhiễm protein. Tuy nhiên, tỷ lệ A260/230 là 1.29, thấp hơn đáng kể so với mức 2, điều này cho thấy có một số chất tạp nhiễm hữu cơ trong mẫu. Lưu ý đỉnh cao ở 220 nm (so với mẫu tinh khiết ở trên) và có một khối phồng ở đỉnh vai tại 270 nm, cũng là dấu hiệu của sự tạp nhiễm. Thông thường, sự tạp nhiễm này xuất phát từ các hóa chất được sử dụng trong quy trình tách chiết như TRIzol, phenol, hoặc muối chaotropic (guanidinium isothiocyanate, còn gọi là GITC). 

Mẫu RNA dưới đây có tỷ lệ A260/280 và A260/230 thấp. Ngoài ra, đỉnh hấp thụ tối đa nằm ở 270 nm. Đường cong này điển hình cho một nồng độ cao của phenol (hoặc GITC) trong mẫu, do quy trình tách chiết RNA bằng TRIzol với việc loại bỏ phenol kém hiệu quả trong quá trình tách pha hữu cơ. Lưu ý thêm, đỉnh cao ở 220 nm và đỉnh axit nucleic thực tế tại 260 nm chỉ xuất hiện dưới dạng một vai nhỏ trong đỉnh phenol lớn hơn tại 270 nm.

Mẫu RNA có nồng độ rất thấp. Do nồng độ thấp, khó có thể đánh giá độ tinh khiết của mẫu bằng cách phân tích các tỷ lệ A260/280 và A260/230. Mẫu này có thể vẫn tốt, nhưng không thể đánh giá bằng NanoDrop vì nằm ngoài ngưỡng nồng độ thấp nhất mà NanoDrop được thiết kế để đo lường. Khuyến nghị sử dụng một phương pháp nhạy hơn, chẳng hạn như Agilent Bioanalyzer hoặc Qubit.

Ngoài ra, bài viết này cũng sẽ cung cấp thêm một số hình ảnh đường tín hiệu khi mẫu bị tạp nhiễm  và chỉ số cần lưu ý ở từng trường hợp.

Hình ảnh đường tín hiệu khi mẫu bị nhiễm Protein

Hình ảnh đường tín hiệu khi nhiễm với các tác nhân thường sót lại và lẫn trong ống mẫu lại sau bước tách chiết.