Cố định trực tiếp các mẫu máu toàn phần để lập hồ sơ tế bào đơn giản

Máu thường được thu thập trong các quy trình lâm sàng thường quy và trong quá trình nghiên cứu, chẳng hạn như thử nghiệm lâm sàng hoặc các nghiên cứu dọc. Từ máu, các bác sĩ và nhà nghiên cứu có thể khai thác nhiều thông tin quan trọng, bao gồm cả những hiểu biết về sự tiến triển của bệnh và hiệu quả cũng như độc tính của thuốc. Tuy nhiên, do sự phân hủy nhanh chóng của các phân tử sinh học bao gồm RNA các phân tích thường chỉ có thể thực hiện trong vòng 24 giờ sau khi thu thập.

Chúng tôi đã phát triển một quy trình cố định và lưu trữ máu toàn phần trực tiếp, giúp bảo vệ tính toàn vẹn của RNA và thông tin từ từng tế bào đơn, nhằm khắc phục hạn chế này. Quy trình chuẩn bị mẫu đơn giản và đáng tin cậy này cho phép thực hiện scRNA-seq trên những mẫu quan trọng nhưng khó xử lý bằng xét nghiệm Chromium Single Cell Gene Expression Flex chính xác và nhạy cảm hơn.

Những thách thức phức tạp đối với việc phân tích tế bào đơn lẻ của mẫu máu

Mẫu máu là loại mẫu đầu vào thường thấy trong bất kì nghiên cứu nào, đặc biệt là nghiên cứu scRNAseq. Việc lập hồ sơ phiên mã ở độ phân giải từng tế bào đơn từ những mẫu này có thể mang lại những hiểu biết vô giá, giúp xác định các biomarker tiên lượng, nghiên cứu cơ chế bệnh lý, và xác định các mục tiêu thuốc mới trong các lĩnh vực như tự miễn dịch, ung thư và bệnh truyền nhiễm.

Tuy nhiên, việc chuyển nhanh từ giai đoạn thu thập máu đến giai đoạn tách tế bào trong quá trình xử lý mẫu là rất quan trọng để thu được thông tin sinh học chính xác. Các nhà nghiên cứu đã lưu ý rằng sự chậm trễ trong giai đoạn này có thể dẫn đến thay đổi trong hồ sơ biểu hiện gen và ảnh hưởng tiêu cực đến kết quả sau này, làm giảm khả năng đạt được những khám phá đột phá. Tác động này có thể càng lớn hơn khi cần tạo ra các bộ dữ liệu lớn, thực hiện các nghiên cứu dọc, hoặc so sánh dữ liệu được thu thập tại nhiều cơ sở. Mặc dù việc xử lý nhanh chóng không phải lúc nào cũng khả thi, nhưng sự nhất quán trong việc xử lý mẫu giữa các thí nghiệm là nền tảng để hạn chế các sai sót kỹ thuật, giữ nguyên tính chính xác của thông tin sinh học, tạo ra dữ liệu chất lượng cao và tránh phân tích lệch lạc.

Các tế bào bạch cầu chiếm ít hơn 1% số tế bào máu nhưng chứa gần như toàn bộ thông tin phiên mã và cần được làm giàu từ máu toàn phần trước khi xét nghiệm tế bào đơn lẻ.Bạch cầu là một quần thể tế bào hỗn hợp bao gồm các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) và bạch cầu hạt—hai loại tế bào có độ ổn định và yêu cầu xử lý khác nhau. PBMC bao gồm các tế bào đuôi gai, bạch cầu đơn nhân và tế bào lympho (tế bào T, tế bào B và tế bào tiêu diệt tự nhiên [NK]). Trong hai loại, PBMC là loại ổn định hơn. Việc làm lạnh là cần thiết để ngăn chặn những thay đổi trong quá trình phiên mã, nhưng chúng có thể được làm giàu từ máu đã làm lạnh lên đến 48 giờ sau khi thu thập. Bạch cầu hạt, chiếm hơn một nửa số bạch cầu lưu thông, bao gồm bạch cầu trung tính, bạch cầu ái toan, bạch cầu ái kiềm và tế bào mast. Nhóm này có thể bị hư hỏng nhanh chóng khi để chúng ở dưới nhiệt độ thấp, do đó, 10x Genomics khuyến nghị làm giàu quần thể tế bào này trong vòng hai giờ sau khi thu thập. Dù phổ biến hơn PBMC, bạch cầu hạt vẫn chưa được nghiên cứu kỹ lưỡng và thường bị loại khỏi các thử nghiệm lâm sàng, một phần do tính dễ vỡ của chúng.

Nếu các nhà nghiên cứu muốn điều tra các mẫu này ở độ phân giải tế bào đơn, việc duy trì tính chính xác về sinh học là bước đầu tiên để đạt được kết quả khả thi. Để làm được điều này, cần phải có quy trình xử lý đáng tin cậy và nhất quán. Đây sẽ là tiền đề cho việc thu được nhiều thông tin giá trị từ quá trình nghiên cứu.

Guo và cộng sự đã sử dụng scRNA-seq để khám phá cách quá trình lão hóa ảnh hưởng đến những thay đổi trong quần thể tế bào NK những nhân tố chủ chốt trong phản ứng chống ung thư và kháng virus. Họ đã xác định được một tập hợp con tế bào NK giống như tế bào trí nhớ, được tích lũy theo tuổi tác và chứng minh rằng chức năng tế bào này có liên quan tích cực đến các trường hợp nhiễm COVID-19 nghiêm trọng hơn (4). Ngoài ra, công trình gần đây của Ng và cộng sự đã sử dụng hồ sơ tế bào đơn để cung cấp cái nhìn sâu sắc về cách bạch cầu trung tính có thể được lập trình lại bởi môi trường vi mô của khối u. Nhóm nghiên cứu đã nhấn mạnh khả năng thích ứng với các tín hiệu từ môi trường này có thể dẫn đến các mục tiêu trị liệu miễn dịch mới, nhắm vào các phản ứng cụ thể của bạch cầu trung tính (5).

Chúng ta có hai nhóm tế bào cực kỳ quan trọng nhưng lại yêu cầu điều kiện bảo quản khác nhau, cùng với những thách thức về mặt hậu cần trong việc xử lý để phân tích từng tế bào. Nếu xem xét các kỹ thuật bảo quản máu nhằm hạn chế sự thoái hóa RNA, chúng ta sẽ thấy các phương pháp đã được chứng minh là tương thích với kĩ thuật giải trình tự bulk RNAseq, nhưng điều này lại không đúng với scRNAseq. Việc duy trì nguyên vẹn các tế bào trong quá trình bảo quản máu đã được chứng minh là một trở ngại lớn.

Hiểu được thách thức này, 10x Genomics đã đưa ra giải pháp cho phép bạn áp dụng các bước cố định đơn giản và tiêu chuẩn hóa cho các mẫu máu toàn phần, tránh được tình trạng khẩn cấp trong việc làm giàu và phân lập tế bào, đồng thời tăng cường độ tin cậy vào kết quả của bạn.

Một giải pháp linh hoạt để phân tích tế bào đơn của các mẫu lâm sàng

Quy trình chuẩn bị mẫu mới của chúng tôi cho phép bạn thực hiện scRNA-seq trên các mẫu máu theo tốc độ của riêng mình. Đây là protocol đầu tiên  cho phép cố định trực tiếp máu toàn phần để chuẩn bị cho quy trình giải trình tự tế bào đơn bằng giải pháp Chromium Single Cell Flex. Giờ đây, Bạn có thể lưu trữ và vận chuyển các mẫu này, cũng như phân ly các tế bào theo lịch trình linh hoạt hoặc tại một địa điểm trung tâm.

Bằng cách cố định mẫu tại điểm thu thập, bạn có thể lưu trữ và vận chuyển mẫu mà không ảnh hưởng đến chất lượng dữ liệu, bảo quản các tế bào mỏng manh và ghi lại các quần thể hoặc trạng thái tế bào nhất thời. Xét nghiệm dựa trên đầu dò có độ nhạy cao này cải thiện kết quả cho các mẫu thử thách, chứng tỏ hiệu suất cao với các tế bào có hàm lượng RNA thấp và các tế bào mỏng manh không bền vững trong các điều kiện bảo quản khác.

Cùng với khả năng lưu trữ và vận chuyển mẫu, việc cố định bằng xét nghiệm Flex cho phép bạn tùy chỉnh quy trình làm việc của mình với nhiều điểm dừng tùy chọn, nghĩa là bạn có thể xử lý mẫu theo lô, từ nhiều địa điểm thu thập, và xử lý chúng sau đó theo lịch trình của mình. Quy trình này cung cấp hai điểm dừng quan trọng: sau khi cố định mẫu máu toàn phần và sau khi phân lập tế bào.

Việc cố định máu toàn phần được thực hiện nhanh chóng và dễ dàng

Giờ đây, scRNA-seq trong translational research (tạm dịch là nghiên cứu tịnh tiến) được đơn giản hóa với quy trình làm việc tối ưu, thân thiện với người dùng để cố định trực tiếp máu toàn phần. Các bước thực hiện nhanh chóng và dễ dàng, đồng thời quy trình đáng tin cậy mang lại kết quả nhất quán cho người dùng và mẫu. Chúng ta cùng xem qua quy trình cụ thể phía dưới.

Đầu tiên, máu được thu thập và thêm vào dung dịch đệm cố định. Thời gian các mẫu được cố định tùy thuộc vào loại tế bào mà bạn muốn tách chiết. Đối với  PBMC, các mẫu nên được cố định ở 4°C qua đêm hoặc lên đến 1 tuần. Nếu bạn muốn tách chiết  cho tất cả các loại bạch cầu (bao gồm cả bạch cầu hạt), các mẫu nên được cố định ở nhiệt độ phòng qua đêm hoặc ở 4°C trong 1 tuần. Tại thời điểm này, bạn có thể tiếp tục làm giàu tế bào hoặc sử dụng glycerol 50% cho việc trữ mẫu để bảo quản ở –80°C trong tối đa 1 tháng.

Nếu không cố định, tốt nhất bạn nên làm giàu các tế bào quan tâm ngay lập tức để duy trì tính chính xác sinh học. Việc phân lập PBMC hoặc bạch cầu từ một mẫu riêng lẻ mất khoảng một giờ, điều này có thể khiến lịch trình làm việc trở nên nặng nề, tùy thuộc vào thời điểm các mẫu đến trong ngày hoặc tuần. Tuy nhiên, với việc cố định máu toàn phần, thời gian thao tác cho quy trình cố định chỉ từ 5 đến 15 phút cho mỗi mẫu.

Bất kể khi nào bạn chọn tiếp tục với các mẫu cố định, các bước tiếp theo của bạn là xử lý sau cố định và phân lập tế bào. Tổng cộng, các bước này mất từ 1 đến 2 giờ, tùy thuộc vào số lượng mẫu bạn đang làm việc cùng một lúc. Một người dùng có thể thoải mái xử lý 8 mẫu cùng một lúc. Tại đây, bạn có một điểm dừng tùy chọn trước khi chuyển sang lai với mẫu dò và phần còn lại của quy trình làm việc scRNA-seq.

Bảo tồn sinh học quan trọng và thu giữ các loại tế bào mỏng manh để tạo ra scRNA-seq chất lượng cao

Tất cả các bước cố định, xử lý và phân lập tế bào đã được tối ưu hóa để mang lại kết quả tốt nhất cho dữ liệu scRNA-seq chất từ các mẫu máu toàn phần. Gene Expression Flex cho thấy kết quả tuyệt vời khi cố định huyền phù tế bào đơn từ mẫu máu toàn phần được cố định. 10x Genomics mong đợi kết quả tương tự khi cố định các tế bào biệt lập đã qua quá trình tách chiết. Trong hình bên dưới, chúng tôi đánh giá dữ liệu cho PBMC, so sánh cả hai quy trình xử lý mẫu cạnh nhau. Chúng tôi quan sát thấy rằng quá trình cố định máu toàn phần mang lại kết quả giải trình tự với độ phức tạp trong phiên mã và độ nhạy tương đương với mẫu tách chiết PBMC bị cô lập. Ngoài ra, cả hai phương pháp đều cho thấy sự phân cụm tế bào tương tự và tỷ lệ các loại tế bào gần như giống hệt nhau.

Bạch cầu hạt là nhân tố miễn dịch quan trọng nhưng về mặt lịch sử rất khó nghiên cứu thông qua scRNA-seq. May mắn thay, những tế bào có hàm lượng RNA thấp, mỏng manh này đạt được hiệu quả đáng kinh ngạc với quy trình cố định máu toàn phần. Giống như các PBMC ở trên, dữ liệu cho thấy độ phức tạp phiên mã, độ nhạy, phân cụm tế bào và tỷ lệ tế bào có thể so sánh được, cho dù bạch cầu đã được làm giàu trước hay sau khi cố định.

Tùy chọn lưu trữ lâu hơn giúp tối ưu hóa cho nghiên cứu của bạn

Chúng ta còn một lựa chọn khác giúp tối ưu hóa nghiên cứu của mình: thêm glycerol vào mẫu cố định và bảo quản ở –80°C trong tối đa 1 tháng. Nhìn chung, bước làm này cho phép người thực hiện có thể tùy chọn thời điểm rã đông và phân lập các tế bào quan tâm cũng như chạy gộp các mẫu cho quy trình Single Cell Flex. Hãng khuyến cáo chúng ta có thể ghép kênh 8 mẫu trong một lần chạy. Cách làm này cho phép người thực hiện có thể chuyển từ bước cố định mẫu sang phân lập tế bào chỉ trong 2 hoặc 3 giờ, trong khi cùng một số lượng mẫu được xử lý riêng lẻ có thể mất tới 8 giờ.

Ngay cả sau 1 tháng bảo quản, những mẫu máu toàn phần cố định này vẫn mang lại dữ liệu tế bào đơn chất lượng cao. Các đường cong độ nhạy cho thấy độ phức tạp của các bản sao phiên mã, sự phân cụm tế bào và tỷ lệ quần thể tế bào tương tự giữa mẫu máu được xử lý và đem đi giải trình tự tế bào đơn ngay sau khi cố định so với máu cố định được bảo quản ở -80°C.

Tận dụng tối đa các mẫu của bạn

Hiệu suất phục hồi tế bào khi cố định máu toàn phần là bao nhiêu?

Từ 1 mL máu toàn phần cố định, bạn có thể lấy lại hơn 1 triệu PBMC hoặc hơn 2 triệu tổng số bạch cầu một chút. Để dễ hiểu, số lượng tế bào đầu vào tối thiểu cho xét nghiệm Flex là 50K tế bào để lai và bạn không bị mất nhiều tế bào trong các bước rửa. Vì vậy, chỉ từ 1 mL máu bạn sẽ nhận được một lượng tế bào khá lớn cho quy trình scRNA tiếp theo.

Tỷ lệ tế bào bị mất đi sau khi rã đông mẫu cố định là bao nhiêu? Có vấn đề gì với việc tế bào bị vón cục sau khi rã đông không?

Chúng tôi không thấy bất kỳ sự khác biệt đáng chú ý nào về số lượng tế bào trước và hiện tượng kết tụ tế bào sau khi đông lạnh. 

Chúng ta có thể giải trình tự tế bào đơn mà không ly giải tế bào hồng cầu (RBC) không?

Hãng thực sự khuyên chúng ta nên làm giàu quần thể PBMC hoặc bạch cầu. RBC không có nhân nên chúng thực sự không có nhiều thông tin phiên mã và điều đó sẽ gây lãng phí cho quá trình chạy từng tế bào của bạn. Vì hồng cầu chiếm hơn 99% thành phần tế bào trong máu nên nếu bạn nạp vào chip 10.000 tế bào thì chỉ có khoảng 100 tế bào là bạch cầu. Do đó, cách làm này thực sự làm mất đi nhiều thông tin từ mẫu của mình nếu chúng ta không loại bỏ hồng cầu. 

Đôi khi, quá trình ly giải hồng cầu diễn ra không như mong đợi và một số RBC vẫn còn tồn tại trong mẫu của chung, nhưng sự hiện diện không đáng kể này sẽ không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất hoặc tiêu tốn dữ liệu giải trình tự. Tuy nhiên, quá trình ly giải hồng cầu nên diễn ra trước khi đem mẫu đi chạy scRNA.

Khả năng tương thích ứng dụng bổ sung

Máu toàn phần cố định có tương thích với phương pháp flow cytometry không?

Trên thực tế, PBMC và bạch cầu cố định có thể được nhuộm và phân tích bằng phương pháp flow cytometry từ máu toàn phần cố định. Tuy nhiên, phương pháp này yêu cầu người thực hiện tự tối ưu hóa các dòng kháng thể vì chúng ta biết rằng việc cố định formaldehyde thực sự làm thay đổi các epitope và điều đó có thể ảnh hưởng đến hiệu quả liên kết của kháng thể. 

Nguồn tham khảo

1. Massoni-Badosa R, et al. Sampling time-dependent artifacts in single-cell genomics studies. Genome Biol 21: 112 (2020). doi: 10.1186/s13059-020-02032-0
2. Qu HQ, et al. Single cell transcriptome analysis of peripheral blood mononuclear cells in freshly isolated versus stored blood samples. Genes (Basel) 14: 142 (2023). doi: 10.3390/genes14010142
3. Barnes M, et al. Gene expression profiles from peripheral blood mononuclear cells are sensitive to short processing delays. Biopreserv Biobank 8: 153–162 (2010). doi: 10.1089/bio.2010.0009
4. Guo C, et al. Single-cell transcriptomics reveal a unique memory-like NK cell subset that accumulates with ageing and correlates with disease severity in COVID-19. Genome Med 14: 46 (2022). doi: 10.1186/s13073-022-01049-3
5. Ng MSF, et al. Deterministic reprogramming of neutrophils within tumors. Science 383: eadf6493 (2024). doi: 10.1126/science.adf6493