1.  Giới thiệu

Trong thập kỷ qua, chi phí giải trình tự DNA giảm mạnh, đưa phương pháp giải trình tự Shotgun Metagenomic trở thành công cụ không thể thiếu để mô tả quần thể vi khuẩn trên nhiều môi trường và hệ thống vật chủ khác nhau, bỏ qua nhu cầu sử dụng các đoạn mồi đặc biệt trong giải trình tự 16S/18S/ITS Amplicon Metagenomic Sequencing.

Giải trình tự Shotgun Metagenomic sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) để cung cấp không chỉ thông tin về chú thích phân loại vi sinh vật (taxonomic annotation) mà còn cho phép lập hồ sơ chức năng, dự đoán gen và tìm hiểu các tương tác vi sinh vật trong cộng đồng. Tuy nhiên, trong quá trình phân tích các mẫu có nguồn gốc từ vật chủ, phương pháp này đặt ra một thách thức với khả năng bao phủ thông tin rộng. Các mẫu giải trình tự Shotgun Metagenomic có hàm lượng vật chủ cao hơn thường bao gồm các mẫu thu được từ môi trường liên quan đến vật chủ hoặc các mẫu mô – nơi mà số lượng vi sinh  vật tương đối thấp so với DNA vật chủ [1-3]. Sau đây là một số ví dụ:

●   Mẫu mô người hoặc động vật: Mẫu thu thập từ các cơ quan, dịch cơ thể hoặc bề mặt niêm mạc của người hoặc động vật. Các mẫu mô thu được từ các cơ quan như gan, cơ, tim và não thường chứa lượng DNA vật chủ đáng kể hơn so với DNA vi sinh vật.

●   Mẫu bệnh phẩm lâm sàng: Mẫu lâm sàng từ bệnh nhân, bao gồm máu, nước tiểu và sinh thiết mô. Các mẫu này có thể có tỷ lệ DNA vật chủ cao hơn, đặc biệt trong trường hợp tải lượng vi khuẩn thấp như nhiễm trùng máu hoặc ở các vị trí vô trùng trong cơ thể.

●   Hệ vi sinh vật liên quan đến vật chủ: Mẫu từ đường ruột, khoang miệng, da, đường hô hấp và sinh dục của người. Mặc dù các vị trí này chứa nhiều loài vi sinh vật đa dạng, nhưng hàm lượng DNA vật chủ có thể vẫn đáng kể, đặc biệt là trong các mẫu từ niêm mạc – nơi có nhiều tế bào vật chủ.

●   Môi trường chiếm ưu thế bởi vật chủ: Môi trường mà sinh vật chủ là nguồn DNA chính, chẳng hạn như cơ sở chăn nuôi, trại động vật và sở thú. Các mẫu từ những môi trường này có thể chứa tỷ lệ DNA vật chủ cao hơn so với các mẫu môi trường có cộng đồng vi sinh vật cân bằng hơn.

●   Mẫu từ các vị trí tương tác vật chủ-mầm bệnh: Như vết thương, ổ áp xe hoặc mô bị nhiễm trùng. Sự hiện diện đồng thời của mầm bệnh và tế bào vật chủ trong các mẫu này có thể làm tăng lượng DNA vật chủ đáng kể.

Hình 1. Shi et al., 2022c [4]. Việc loại bỏ DNA vật chủ trước khi giải trình tự có thể cải thiện độ phân giải DNA vi khuẩn. Màu xám biểu thị DNA vật chủ; màu đỏ, vàng và hồng biểu thị các loài vi khuẩn khác nhau; và màu xanh lá cây và màu xanh lam lần lượt đại diện cho virus và vi khuẩn cổ (archaea). mNGS: giải trình tự thế hệ tiếp theo metagenomic. HTS, giải trình tự thông lượng cao.

2.      Các phương pháp loại bỏ DNA vật chủ hiện nay

Việc phát triển một phương pháp đáng tin cậy để chuẩn hóa việc loại bỏ các DNA vật chủ trong giải trình tự Shotgun Metagenomic là điều thiết yếu với hầu hết tất cả các nghiên cứu tập trung vào hệ vi sinh vật có nguồn gốc từ vật chủ. Dưới đây là các phương pháp loại bỏ DNA vật chủ được sử dụng phổ biến hiện nay [4,5].

●   Phân tách vật lý (lọc vi mô và ly tâm): Các tế bào vật chủ thường có kích thước lớn hơn đáng kể so với tế bào vi sinh vật, do đó có thể được tách ra bằng các phương pháp như lọc qua màng, ly tâm tốc độ thấp, hoặc phân loại tế bào bằng dòng chảy (flow cytometry) (Hình 2B).

●   Làm giàu DNA vi khuẩn: Phương pháp này tận dụng sự khác biệt về tần suất methyl hóa cytosine giữa DNA nhân thực (vật chủ) và sinh vật nhân sơ (vi sinh vật). Bằng cách sử dụng hạt từ liên kết với MBD-Fc (protein gắn vùng CpG-methyl hóa), các trình tự DNA vật chủ đã được methyl hóa có thể bị bắt giữ và loại bỏ bằng từ trường, trong khi DNA vi sinh vật (không bị methyl hóa CpG) vẫn còn trong dung dịch nổi và có thể được sử dụng cho các bước phân tích tiếp theo (Hình 2C).

●   Xử lý bằng enzyme và hóa chất (phân hủy tế bào vật chủ có chọn lọc và xử lý DNase/PMA): Phương pháp phổ biến để loại bỏ DNA vật chủ trước khi tách chiết  là sử dụng dung dịch phân giải chọn lọc (ví dụ: saponin) để phá vỡ tế bào người, sau đó xử lý với các enzyme nuclease để phân hủy DNA (Hình 2D), hoặc sử dụng propidium monoazide (PMA) – một loại thuốc nhuộm liên kết DNA nhạy sáng – để bất hoạt DNA vật chủ (Hình 2E).

Hình 2. Hiệu quả của năm phương pháp loại bỏ DNA vật chủ để giải trình tự Shotgun Metagenomic. MBD là viết tắt của miền liên kết methyl-CpG của protein MBD2 ở người được gắn vào đoạn Fc của kháng thể IgG ở người [5].

3.      Các phương pháp tiếp cận tin sinh học:

• Căn chỉnh trình tự để loại bỏ DNA vật chủ: Phương pháp này liên quan đến việc căn chỉnh dữ liệu giải trình tự metagenomic với trình tự bộ gen vật chủ đã biết và loại bỏ các trình tự có độ tương đồng cao với bộ gen vật chủ. Quá trình này yêu cầu phần mềm căn chỉnh hiệu quả như Bowtie2 [7], BWA [8], v.v.
• Phương pháp dựa trên K-mer: Không phụ thuộc vào bộ gen tham chiếu, phương pháp này xác định và loại bỏ các trình tự vật chủ bằng cách so sánh phân bố tần suất của các đoạn trình tự ngắn (k-mer). Phương pháp này phù hợp với các tình huống chưa có thông tin hoặc thông tin về bộ gen vật chủ chưa hoàn chỉnh [6, 9].

Tóm lại, việc loại bỏ DNA vật chủ hiệu quả thường đòi hỏi sự kết hợp của nhiều phương pháp và công nghệ khác nhau [4]. Ví dụ, quá trình có thể bắt đầu bằng tách vật lý để giảm khối lượng tế bào vật chủ, sau đó là xử lý enzyme để phân hủy DNA vật chủ còn sót lại. Cuối cùng, các bước xử lý tin sinh học sẽ loại bỏ nốt các trình tự vật chủ còn tồn tại sau quá trình giải trình tự. Mỗi phương pháp có phạm vi ứng dụng riêng, phụ thuộc vào loại mẫu, tỷ lệ DNA vật chủ so với vi sinh vật, cũng như mục tiêu cụ thể của nghiên cứu. Việc lựa chọn đúng phương pháp có thể ảnh hưởng đáng kể đến chi phí, độ phức tạp và độ nhạy của phân tích metagenomics.

4.  Dịch vụ loại bỏ DNA vật chủ trong Metagenomics của Novogene

Novogene áp dụng quy trình hai bước để loại bỏ DNA vật chủ một cách hiệu quả: đầu tiên là phá vỡ chọn lọc tế bào vật chủ bằng phương pháp phân giải chọn lọc, sau đó là tiêu hủy DNA vật chủ bằng enzyme. Việc phá vỡ có chọn lọc được thực hiện bằng cách điều chỉnh pH và nhiệt độ của dung dịch phân giải, sao cho không gây ảnh hưởng đến tế bào vi sinh vật. Hiệu quả của bước này phụ thuộc vào sự khác biệt về độ nhạy của tế bào vật chủ và tế bào vi sinh vật với các điều kiện phân giải. Khi DNA vật chủ được giải phóng, nó sẽ được phân hủy bởi DNase hoặc bị bất hoạt bằng PMA liên kết cộng hóa trị (Hình 3).

Hình 3. Dịch vụ loại bỏ DNA vật chủ metagenomic của Novogene trước khi giải trình tự.

Phương pháp phối hợp giữa cơ học và hóa học giúp phá vỡ hiệu quả các tế bào nguyên vẹn, hỗ trợ quá trình tinh sạch DNA vi sinh vật. Để xử lý các trình tự DNA vật chủ còn sót lại trong dữ liệu giải trình tự, bước xử lý tin sinh học cuối cùng được áp dụng sau cùng.

5.  Ưu điểm nổi bật của dịch vụ giải trình tự Shotgun Metagenomic cung cấp bởi GeneSmart cùng Novogene

●   Dịch vụ trọn gói xuất sắc, thời gian xử lý nhanh, chất lượng cao và chi phí hợp lý.

●  Phân tích tin sinh học chuyên sâu, cung cấp dữ liệu toàn diện về gen được chú thích, các con đường chuyển hóa và hồ sơ gen kháng kháng sinh.

●  Chiến lược linh hoạt kết hợp giữa giải trình tự sâu và giải trình tự nông hiệu quả trên nền tảng đọc ngắn (short-read), phù hợp với nhiều ứng dụng khác nhau, mang lại kết quả phân tích toàn diện.

6. Nguồn tham khảo

[1] Human Microbiome Project Consortium. “A framework for human microbiome research.” Nature vol. 486,7402 215-21. 13 Jun. 2012, doi:10.1038/nature11209

[2] Chiu, Charles Y, and Steven A Miller. “Clinical metagenomics.” Nature reviews. Genetics vol. 20,6 (2019): 341-355. doi:10.1038/s41576-019-0113-7

[3] Heravi, Fatemah Sadeghpour et al. “Host DNA depletion efficiency of microbiome DNA enrichment methods in infected tissue samples.” Journal of microbiological methods vol. 170 (2020): 105856. doi:10.1016/j.mimet.2020.105856

[4] Shi Y, Wang G, Lau HC, Yu J. Metagenomic Sequencing for Microbial DNA in Human Samples: Emerging Technological Advances. Int J Mol Sci. 2022;23(4):2181. Published 2022 Feb 16. doi:10.3390/ijms23042181

[5] Marotz, Clarisse A et al. “Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion.” Microbiome vol. 6,1 42. 27 Feb. 2018, doi:10.1186/s40168-018-0426-3

[6] Langmead, Ben et al. “Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.” Genome biology vol. 10,3 (2009): R25. doi:10.1186/gb-2009-10-3-r25

[7] Li, Heng, and Richard Durbin. “Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.” Bioinformatics (Oxford, England) vol. 25,14 (2009): 1754-60. doi:10.1093/bioinformatics/btp324

[9] Wood, Derrick E, and Steven L Salzberg. “Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.” Genome biology vol. 15,3 R46. 3 Mar. 2014, doi:10.1186/gb-2014-15-3-r46