Kỹ thuật điện di đứng SDS-PAGE để phân tách các protein

Kỹ thuật điện di đứng SDS-PAGE là gì?

Điện di đứng trên gel poly-acrylamide (PAGE) là kỹ thuật được sử dụng để phân tách các protein, đôi khi là để phân tách DNA/RNA trong mẫu để định tính và định lượng. Trong đó, điện di đứng trên gel poly-acrylamide có sử dụng sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất.

Nguyên lý hoạt động của SDS-PAGE

Kỹ thuật SDS-PAGE cho phép protein phân tách dựa trên chiều dài mạch polypeptide hay nói cách khác là dựa trên khối lượng phân tử. Để làm được điều này, cần sử dụng sodium dodecyl sulfate (SDS) để protein chuyển về cấu trúc bậc 1 và tạo điện tích âm tỷ lệ thuận theo khối lượng (mass-to-charge ratio). Điện tích âm tỷ lệ thuận theo khối lượng sẽ giúp loại bỏ ảnh hưởng của điện tích đến quá trình điện di.

Hệ thống Laemmli là hệ thống gel phân tách protein bằng SDS-PAGE được sử dụng phổ biến nhất. Hệ thống Laemmli sử dụng gel tris-glycine, bao gồm gel cô (stacking gel) dùng để tập trung protein thành 1 vạch duy nhất (cùng xuất phát điểm) và gel tách (resolving gel hay separating gel) dùng để phân tách các protein, nồng độ của gel tách được sử dụng sẽ khác nhau tùy vào kích thước protein cần phân tách. Hệ thống này sử dụng 3 hệ đệm khác nhau:

• Đệm để chạy điện di (Tris-pH 8.3).
• Đệm trong gel cô (Tris-pH 6.8)
• Đệm trong gel tách (Tris-pH 8.8)

Các protein đã xử lý với SDS nếu điện di trong điện trường thông thường thì chúng sẽ di chuyển giống nhau và phân tách, vì vậy cần phải sử dụng gel poly-acrylamide để tạo sự chọn lọc dựa trên kích thước. Kỹ thuật điện di đứng sử dụng gel poly-acrylamide gọi là PAGE.

Quy trình thực hiện SDS-PAGE

Quy trình SDS-PAGE có thể thực hiện trên DNA/RNA hoặc protein, tuy nhiên trọng phạm vi bài viết này chúng tôi sẽ tập trung về chuẩn bị mẫu protein.

Chuẩn bị mẫu

Protein tách chiết sẽ được bổ sung SDS và thuốc nhộm đánh dấu (tracking dye), đôi khi có thể sử dụng hóa chất kết hợp với đun nóng để loại bỏ bớt liên kết disulfide.

Chuẩn bị gel poly-acrylamide

Gel poly-acrylamide thường chứa acrylamide, bis-acrylamide, chất biến tính (SDS hoặc urea), dung dịch đệm để điều chỉnh pH. Ammonium persulfate (APS) và TEMED sẽ được bổ sung để bắt đầu quá trình polymer hóa, bis-acrylamide trong hỗn hợp sẽ giúp tạo cầu nối giữa 2 phân tử poly-acrylamide. Tỷ lệ bis-acrylamide : acrylamide thường là 1 : 35.

Ngay sau khi bổ sung APS và TEMED, cần phải đổ gel ngay trước khi chúng bị polymer hóa. Gel sau khi đổ thường được loại bọt khí bằng butanol (cho protein) hoặc hút chân không. Thực hiện đổ gel tách, sau đó đổ tiếp gel cô ở phía trên và cắm lược vào phần gel cô để tạo giếng ngay sau khi đổ gel. Nồng độ acrylamide trong gel cô là 5% còn trong gel tách thường từ 5 ~ 25%, tùy vào kích thước protein cần phân tách, protein càng nhỏ thì cần nồng độ gel càng cao.

Điện di trên gel poly-acrylamide:

Khác với điện di ngang trên gel agarose, bồn điện di đứng được thiết kế gồm 2 buồng chứa dung dịch đệm (buffer) gọi là buồng trong và buồng ngoài (inner và outer) hoặc có nơi gọi là buồng trên và buồng dưới (upper và lower).

Buồng trong (buồng trên) chứa điện cực âm và tiếp xúc với đầu trên của tấm gel pol-acrylamide, còn buồng ngoài (buồng dưới) chứa điện cực dương và tiếp xúc với đầu dưới của tấm gel. Protein tích điện âm (sau khi xử lý SDS) sẽ di chuyển từ trên xuống về phía điện cực dương.

Quan sát protein sau điện di

Sau khi điện di xong, protein cần được làm hiện hình để có thể quan sát. Có 2 phương pháp phổ biến để làm hiện hình protein:
– Phương pháp không đặc hiệu: Sử dụng thuốc nhuộm để nhuộm tất cả protein, các thuốc nhuộm phổ biến là Coomassive Brilliant Blue hoặc Ruby Pro
– Phương pháp đặc hiệu: Sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện protein mục tiêu, thường là thông qua một kỹ thuật có tên gọi là Western Blot.

Sau khi làm hiện hình protein, có thể thực hiện ghi nhận hình ảnh protein thông qua hệ thống đọc gel (gel document system) hay còn gọi là hệ thống chụp ảnh gel. Hệ thống đọc gel sẽ khác nhau tùy vào phương pháp làm hiện hình protein sử dụng thuốc nhuộm, kháng thể gắn tín hiệu huỳnh quang hay kháng thể gắn tín hiệu phát quang hóa học.