NanoDrop: Ưu, nhược điểm và cách sử dụng máy đo quang phổ NanoDrop

NanoDrop (Máy đo quang phổ NanoDrop) đã chứng minh là một công cụ quan trọng trong phòng thí nghiệm, nhờ khả năng định lượng nhanh chóng và chính xác các mẫu DNA, RNA, và protein với thể tích mẫu rất nhỏ. Dù có những ưu điểm vượt trội về tính tiện lợi và hiệu quả, người sử dụng cần lưu ý đến một số hạn chế và cẩn thận khi thao tác, đặc biệt là trong việc xác định loại yếu tố gây nhiễm bẩn và hiểu rõ dải đo tuyến tính của thiết bị. Việc sử dụng đúng quy trình và lựa chọn phương pháp thích hợp sẽ giúp bạn tối ưu hóa kết quả và đảm bảo độ chính xác trong nghiên cứu của mình.

Với máy đo quang phổ NanoDrop, việc định lượng và kiểm tra chất lượng DNA, RNA, và protein trở nên dễ dàng và không tốn nhiều thời gian cho việc chuẩn bị mẫu. Chỉ cần một lần hút-nhả pipet, một nút bấm, và một tờ giấy để vệ sinh khu vực đo là bạn có thể hoàn thành quy trình.

Dưới đây là những gì bạn cần biết về ưu và nhược điểm của phương pháp này, kèm theo hướng dẫn ngắn gọn về cách sử dụng thiết bị.

NanoDrop là gì?

Máy đo quang phổ NanoDrop là một dụng cụ phòng thí nghiệm phổ biến có thể đo nồng độ DNA, RNA và protein trong một giọt thể tích chỉ từ 1 đến 2 μL trên bệ.

Với lượng mẫu nhỏ như vậy giúp giảm thiểu thời gian chuẩn bị và dọn dẹp, cho phép bạn đo nhiều mẫu trong vòng chưa đầy một phút, so với việc sử dụng cuvet truyền thống 1 cm.

Giá trị nồng độ được báo cáo bằng ng / μL đối với DNA và mg / mL đối với protein.

Hãy nhớ rằng: 1 ng/µL = 1 µg/mL = 1 mg/L

Vì vậy, máy đo quang phổ NanoDrop là một giải pháp hoàn hảo đối với hầu hết các ứng dụng trong phòng thí nghiệm của bạn.

Thậm chí tốt hơn, nếu bạn đang định lượng hơn 96 mẫu cùng một lúc, các dòng thiết bị NanoDrop 8000 và NanoDrop Eight có thể đọc tối đa 8 mẫu cùng một lúc giúp đẩy nhanh hiệu quả cũng như tiến độ công việc cho bạn.

Làm sao để sử dụng thiết bị đo quang phổ NanoDrop?

Dưới đây là quy trình đơn giản để sử dụng máy đo quang phổ NanoDrop cho việc định lượng và kiểm tra chất lượng các mẫu DNA/RNA/Protein:

1. Mở phần mềm và máy đo quang phổ NanoDrop.
2. Chọn loại mục tiêu cần đánh giá (dsDNA, ssDNA, ssRNA, Oligonucleotide, Protein,…).
3. Nhẹ nhàng nhấc cánh tay của thiết bị lên.
4. Vệ sinh bệ đỡ và bên dưới cánh tay thiết bị bằng nước cất từ 2-3 lần và lau khô bằng khăn giấy không bụi.
5. Pipet 1-2 µL dung dịch blank, hạ cánh tay xuống.
6. Chọn trên phần mềm tính năng đo “Blank”.
7. Nâng cánh tay thiết bị và dùng giấy không bụi lau sạch.
8. Tiến hành đo mẫu sau khi Blank hoàn tất. (Lặp lại các bước 3-7, không chọn tính năng “Blank”)

Hãy luôn cho thiết bị biết rằng bạn đang thao tác với mục tiêu đánh giá nào

Máy đo quang phổ NanoDrop có khả năng đo được nhiều mục tiêu khác nhau nhờ vào dải phổ rộng UV-Vis từ tia cực tím (UV) đến ánh sáng khả kiến (Visible). Tuy nhiên, thiết bị sẽ không tự xác định được mẫu trên bệ là DNA, RNA hay protein. Bạn phải chỉ định mục tiêu đánh giá trước khi thực hiện các bước tiếp theo để đảm bảo kết quả chính xác.

Trong trường hợp bạn thao tác sai mục tiêu với quá nửa lượng mẫu, bạn có thể tính toán lại dựa trên bảng hệ số hấp thụ dưới đây:

Bảng 1: Nồng độ tại A260 tại giá trị 1,0 với những loại mẫu khác nhau

Mục tiêu	Nồng độ (µg/mL)
dsDNA (Double stranded DNA)	50
ssRNA (Single stranded RNA)	40
ssDNA (Single stranded DNA)	33
Protein (Đo ở A280)	1

Sự khác biệt này là do số lượng và loại liên kết cấu thành khác nhau giữa các loại mẫu. Acid nucleic sẽ hấp thụ tối đa ở A260, còn protein ở A280.

Hãy lưu ý rằng: Các mẫu DNA, RNA và protein có giá trị tinh sạch tốt dựa vào tỷ lệ A260/280 tuần tự là: 1.8, 2.0 và 0.6. Ngoài ra, đơn vị nồng độ khi phần mềm đưa ra sẽ là ng/µL.

Cẩn Thận Với Những Phương Pháp Chiết Xuất Mẫu Nhanh Gọn Và Sơ Sài

Bất kể phương pháp định lượng nào, có hai câu hỏi quan trọng cần đặt ra sau mỗi lần chiết xuất acid nucleic:

1. Có sự nhiễm bẩn nào trong ống mẫu của tôi không?
2. Nếu có, đó là loại nhiễm bẩn gì?

Dựa trên tỷ lệ A260/280, mẫu DNA của bạn có thể trông hoàn hảo, nhưng máy quang phổ NanoDrop có thể đang phóng đại kết quả. Điều này thường xảy ra với hầu hết các máy quang phổ, do thiết bị chỉ đọc độ hấp thụ ở các bước sóng cụ thể.

Nhưng DNA không phải là thứ duy nhất hấp thụ ở bước sóng 260 nm. RNA cũng hấp thụ tại đây. Phenol thì hấp thụ gần đó ở khoảng 270 nm, và tất cả điều này có thể khiến nồng độ được báo cáo của bạn tăng lên.

Tuy nhiên chỉ số Tỷ Lệ Hấp Thụ giữa các bước sóng khác nhau có thể giúp bạn giải quyết vấn đề này.

Một điểm cần lưu ý khác là giá trị A260/230 của bạn, tương tự như tỷ lệ A260/280, nên trên mức 1,8 đối với DNA và trên mức 2,0 đối với RNA (theo nguyên tắc chung).

Dưới đây là một số gợi ý chung để giúp bạn diễn giải các tỷ lệ hấp thụ cho các trường hợp phổ biến:

• Tỷ lệ A260/280 thấp hoặc xuất hiện đỉnh lớn tại A280: nhiễm bẩn protein trong acid nucleic.
• Tỷ lệ A230 cao: nhiễm bẩn phenol, EDTA hoặc carbohydrate.
• Xuất hiện các đỉnh tín hiệu nhỏ hoặc tín hiệu định hấp thụ cao hơn mong đợi ở phía bên phải của biểu đồ: nhiễm bẩn từ việc chuyển lớp trong quá trình tách pha khi chiết xuất.

Một cách để đảm bảo mẫu sạch hơn là tiến hành tái kết tủa, rửa bằng ethanol, để khô lâu hơn, và hòa tan lại trong một lượng mới TE hoặc nước tinh khiết. Sau khi tái tinh sạch, nồng độ được báo cáo có thể giảm so với trước đây, nhưng đó là do bạn đã loại bỏ thành công các yếu tố nhiễm bẩn ảnh hưởng đến tín hiệu hấp thụ.

Xem kỹ với dải đo tuyến tính của thiết bị NanoDrop 

Bảng 2: Dải đo tuyến tính của máy quang phổ NanoDrop thay đổi tùy thuộc vào dòng thiết bị NanoDrop

Dòng thiết bị	Khoảng tuyến tính (ng/µL)	Khoảng tuyến tính (mg/mL)
NanoDrop 2000	2–15,000	0.1–400
NanoDrop 8000	2.5–3700	0.1–100
NanoDrop One	0.2–27,500	0.06–820
NanoDrop Eight	0.2–10,000	0.06–300

Ghi chú: Các giá trị ng/µL tương ứng với mẫu dsDNA với A260 và các giá trị mg/mL tương ứng mẫu BSA (bovine serum albumin) với A280

Dải đo tuyến tính là phạm vi mà các phép đo độ hấp thụ do thiết bị thực hiện tỷ lệ thuận với nồng độ mẫu. Hay nói cách khác, đó là phạm vi mà các phép đo tuân theo định luật Beer—Lambert.

Trong hầu hết các trường hợp, việc chiết xuất acid nucleic của bạn sẽ nằm trong phạm vi đo lường của máy quang phổ NanoDrop. Tuy nhiên, nếu thao tác với mẫu có nồng độ quá thấp hoặc chiết xuất từ tế bào đơn lẻ, hãy xem xét các phương pháp khác như đo huỳnh quang hoặc qPCR.