Theo phương pháp truyền thống, vi sinh vật thường được nuôi cấy trên dĩa Petri để phân lập và xác định các loài. Tuy nhiên, phương pháp này có hạn chế lớn về khả năng phát hiện các vi sinh vật không thể nuôi cấy được trong môi trường phòng thí nghiệm.

Việc nghiên cứu thành phần cộng đồng vi sinh vật không cần nuôi cấy trở thành một lựa chọn thay thế nhờ vào sự phát triển của các kỹ thuật phân tử hiệu quả cao và chi phí thấp. Hai phương pháp chủ yếu được sử dụng để phân loại và xác định sự phong phú của microbiome hoặc các môi trường phức tạp là giải trình tự rRNA hoặc shotgun metagenomics.

Kết quả thu được từ cả hai phương pháp này đều đóng vai trò quan trọng trong việc phân tích thành phần phân loại của cộng đồng vi sinh vật. Tuy nhiên, chúng có những khác biệt sau:

• Hiệu quả thu hồi
• Số lượng reads cần thiết khi giải trình tự để có hồ sơ phân loại chính xác
• Khả năng phân giải ở cấp độ giống và loài
• Tính hữu ích trong nghiên cứu các gen chức năng

Do đó, việc lựa chọn phương pháp phù hợp với mục tiêu nghiên cứu đòi hỏi cần cân nhắc kỹ lưỡng ưu nhược điểm của hai kỹ thuật giải trình tự amplicon và shotgun metagenomics. Đây cũng chính là trọng tâm của bài blog này.

16S/18S/ITS Amplicon Metagenomic Sequencing

16S/18S/ITS Amplicon Metagenomic Sequencing là phương pháp giải trình tự DNA nhắm vào các vùng cụ thể (amplicon) để phân tích thành phần vi sinh vật trong các mẫu phức tạp. Phương pháp này sử dụng PCR để khuếch đại các vùng siêu biến đổi ngắn (<500 bp) thuộc các gen bảo tồn hoặc vùng liên gen, sau đó tiến hành giải trình tự thế hệ mới (NGS).

Phương pháp này cho phép nhận diện và phân biệt các loài vi sinh vật dựa trên các gene marker đặc hiệu, bao gồm:

• 16S rRNA: vi khuẩn và vi khuẩn cổ
• 18S rRNA: sinh vật nhân thực
• Internal Transcribed Spacer (ITS): nấm (bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài liên quan khác).

Điều này cho phép phân tích phát sinh loài và phân loại toàn diện. Xem hình 1 bên dưới để hiểu rõ hơn về các gen mục tiêu sử dụng trong quy trình giải trình tự Amplicon Metagenomics.

Hình 1: Các gen marker được sử dụng trong Amplicon Metagenomic Sequencing

Shotgun Metagenomic Sequencing

Shotgun Metagenomic Sequencing là phương pháp giải trình tự ngẫu nhiên (“shotgun”) toàn bộ DNA của vi sinh vật. Phương pháp này cho phép phân tích ở cấp độ loài và phân loài với độ phân giải cao. So với Amplicon, Shotgun Metagenomics có ưu điểm phát hiện đồng thời virus, vi khuẩn, vi khuẩn cổ và vi sinh vật nhân thực, không cần lựa chọn mồi (primer) đồng thời cung cấp thông tin về toàn bộ bộ gen.

Ngược lại, Amplicon Metagenomic Sequencing tập trung vào giải trình tự các vùng DNA đặc hiệu như 16S rRNA, 18S rRNA hay ITS, giúp phân loại và xác định sự đa dạng của vi sinh vật trong mẫu một cách nhanh chóng và hiệu quả.

Khi áp dụng phương pháp này, Novogene hỗ trợ các nhà nghiên cứu khám phá các quá trình tế bào, thông tin môi trường, bệnh lý, quá trình trao đổi chất, hệ sinh thái vi sinh vật và chú thích gen kháng sinh.

Các yếu tố cần cân nhắc để lựa chọn giữa Amplicon và Shotgun Metagenomic Sequencing

1. Loại mẫu

Sự hiện diện của DNA vật chủ trong mẫu là một yếu tố quan trọng cần cân nhắc khi lựa chọn phương pháp giải trình tự. Amplicon Metagenomic Sequencing sử dụng các mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu, nên nguy cơ khuếch đại DNA vật chủ không mong muốn là khá thấp. Ngược lại, Shotgun Metagenomics thu nhận toàn bộ DNA trong mẫu, dẫn đến khả năng các đoạn DNA không phải của vi sinh vật chiếm ưu thế, từ đó ảnh hưởng đến độ chính xác của dữ liệu microbiome.

Mặc dù có thể loại bỏ DNA vật chủ trước khi chuẩn bị thư viện giải trình tự shotgun (ví dụ như tách biệt tế bào người và vi khuẩn), quá trình này đôi khi làm giảm đáng kể lượng DNA vi sinh vật còn lại, gây khó khăn cho việc giải trình tự. Vì vậy, với những mẫu có tỷ lệ DNA vật chủ cao so với vi sinh vật như da, mô hoặc máu, giải trình tự vừng 16S rRNA thường là lựa chọn thích hợp hơn. Trong khi đó, đối với các mẫu chứa mật độ vi sinh vật cao như phân hoặc đất, cả hai phương pháp đều có thể áp dụng một cách hiệu quả.

2. Độ phân giải và phạm vi phân loại

Việc lựa chọn giữa 16S rRNA Amplicon Sequencing và Shotgun Metagenomic Sequencing thường phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu, cụ thể là bạn cần phạm vi nhận diện vi khuẩn rộng, độ phân giải phân loại chi tiết hay sự cân bằng giữa cả hai.

16S rRNA Amplicon Sequencing cho phân loại giới hạn ở cấp chi (ví dụ: Bifidobacteria) khi sử dụng giải trình tự đoạn đọc ngắn (short-read sequencing). Giải trình tự đoạn đọc dài (long-read sequencing) có thể nâng cao độ phân giải đến cấp loài, tuy nhiên độ chính xác còn chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như vùng gen 16S rRNA được lựa chọn, mức độ đa dạng sinh học của mẫu và quy trình phân tích tin sinh học.

Ngược lại, Shotgun Metagenomics cung cấp cái nhìn toàn diện hơn, cho phép phát hiện đa dạng các loại sinh vật, bao gồm vi khuẩn, vi khuẩn cổ, nấm, sinh vật nguyên sinh, virus, thậm chí cả DNA vật chủ mà không gặp phải sự sai lệch do khuếch đại mồi. Phương pháp này cũng cho độ phân giải phân loại cao hơn, thường xác định vi khuẩn đến cấp loài (ví dụ: Bifidobacterium longum) và trong nhiều trường hợp còn chi tiết đến cấp chủng (ví dụ: Bifidobacterium longum 35624), nhờ vào việc lập hồ sơ toàn bộ hệ gen và phân tích các biến thể nucleotide đơn (SNV).

Dù Shotgun Metagenomics cho phép khảo sát toàn bộ hệ gen vi sinh vật, Amplicon Metagenomics vẫn là phương pháp hiệu quả và tiết kiệm cho các nghiên cứu tập trung vào phân tích các nhóm vi khuẩn cụ thể với độ phân giải phân loại vừa phải.

3. Chi phí

Mặc dù Shotgun Metagenomics cung cấp lượng dữ liệu phong phú và chi tiết hơn nhiều so với 16s rRNA Metagenomics, chi phí cho việc thu thập dữ liệu bổ sung này cũng cao hơn đáng kể. Để cân bằng giữa nhu cầu và chi phí, bạn có thể giải trình tự 16s rRNA Metagenomics trên tất cả các mẫu và chỉ thực hiện Shotgun Metagenomics trên một số mẫu tiêu biểu trong nghiên cứu.

4. Thành phần so với chức năng

Nếu bạn muốn tìm hiểu kỹ về nội dung gen thực sự có trong hệ vi sinh, như các gen kháng kháng sinh hay gen gây độc lực, thì giải trình tự metagenomics shotgun sẽ là lựa chọn phù hợp hơn. Novogene hiện cung cấp hai loại dịch vụ cho phương pháp Shotgun Metagenomics:

• Shotgun Metagenomics Reads-Mapping: Đây là phương pháp nhanh hơn, sử dụng dữ liệu có sẵn để đối chiếu các đoạn đọc với các cơ sở dữ liệu đã biết. Phù hợp để xác định thành phần vi sinh vật và chức năng của các gen đã biết, nhưng không phát hiện được gen kháng kháng sinh hay gen mới.
• Deep Shotgun Metagenomics (Assembly – Based): Phương pháp này tái dựng lại bộ gen vi sinh từ đầu, cho phép phân tích sâu hơn về chức năng, bao gồm cả việc tìm ra các gen kháng thuốc và gen chưa từng được biết đến trước đó.

Cả hai cách đều giúp hiểu rõ hơn về chức năng của hệ vi sinh, nhưng kĩ thuật Deep Shotgun Metagenomics (Assembly – Based) sẽ phù hợp hơn nếu bạn muốn khám phá gen mới và phân tích khả năng kháng kháng sinh của các gen này.

Hình 3: Kết quả phân tích demo của Novogene cho Shotgun Metagenomic Sequencing.

5. Tóm tắt

Các yếu tố	Giải trình tự rRNA 16S/18S/ITS	Shotgun Metagenomics (Read-based)	Shotgun Metagenomics (Assembly-based)
Sự tạp nhiễm DNA vật chủ	Thấp (nhưng thành công của PCR phụ thuộc vào việc không có chất ức chế và sự hiện diện của hệ vi sinh vật có thể phát hiện được)	Cao, thay đổi tùy theo loại mẫu (nhưng có thể giảm thiểu bằng cách điều chỉnh độ sâu giải trình tự)	Cao, thay đổi tùy theo loại mẫu (nhưng có thể giảm thiểu bằng cách điều chỉnh độ sâu giải trình tự)
Chi phí	Hiệu quả hơn về mặt chi phí	Gấp 2-3 lần	Gấp 2-3 lần
Mức độ phân loại	Chi (loài hoặc dưới loài nếu giải trình tự long-read); phụ thuộc vào vùng mục tiêu	Loài (đôi khi là các chủng và biến thể nucleotide đơn nếu giải trình tự đủ sâu)	Loài (đôi khi là các chủng và biến thể nucleotide đơn nếu giải trình tự đủ sâu)
Phạm vi phân loại	Amplicon đặc hiệu: + 16S rRNA: Vi khuẩn và vi khuẩn cổ + 18S rRNA: Protist và tảo + ITS: Nấm (bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài liên quan khác)	Tất cả các loài, bao gồm cả virus	Tất cả các loài, bao gồm cả virus
Phân loại và chú thích chức năng	x (có thể dự đoán chức năng khi dùng pipeline phù hợp)	✓	✓
Chú thích về kháng thuốc kháng sinh	x	x	✓

6. Dịch vụ Novogene

Novogene cung cấp giải pháp giải trình tự toàn diện từ đầu đến cuối, được thiết kế phù hợp với yêu cầu cụ thể của từng nghiên cứu. Dịch vụ bao gồm từ khâu chuẩn bị mẫu, thực hiện giải trình tự, phân tích tin sinh học cho đến bước giải thích kết quả, giúp các nhà nghiên cứu hiểu rõ về thành phần và chức năng của hệ vi sinh vật.

Với vai trò là nhà phân phối chính thức của Novogene tại Việt Nam, GeneSmart cam kết mang đến các dịch vụ giải trình tự bộ gen tiên tiến cùng sự hỗ trợ chuyên môn từ đội ngũ chuyên gia của Novogene, góp phần làm cho các giải pháp này trở nên dễ tiếp cận hơn đối với cộng đồng khoa học trong nước.

Trong các bài blog tiếp theo, chúng tôi sẽ đi sâu vào quy trình phân tích tin sinh học và khám phá các ứng dụng thực tiễn của cả hai phương pháp: Amplicon sequencing (16S/18S/ITS) và Shotgun Metagenomic sequencing.

Tìm hiểu thêm về dịch vụ 16S/18S/ITS Amplicon hoặc Shotgun Metagenomic Sequencing tại đây

Tài liệu tham khảo

(1) Novogene. 16S rRNA and Shotgun: Approaches to Metagenomics. Available at: https://www.novogene.com/amea-en/resources/blog/16s-rrna-and-shotgun-approaches-to-metagenomics/

(2) Gupta, A. Metagenomics vs. 16S sequencing: Decoding microbial communities. Available at: https://www.linkedin.com/pulse/metagenomics-vs-16s-sequencing-decoding-microbial-communities-j74ue/

(3) Microbiome Insights. 16S rRNA sequencing vs. shotgun metagenomic sequencing. Available at: https://blog.microbiomeinsights.com/16s-rrna-sequencing-vs-shotgun-metagenomic-sequencing#taxonomic-resolution