Việc tách chiết DNA và RNA là bước khởi đầu cho nhiều quy trình trong sinh học phân tử, chẩn đoán và nghiên cứu hệ gen. Sau khi tách chiết, việc định lượng và phân tích chất lượng là cần thiết để xác định nồng độ axit nucleic và sự phù hợp của mẫu cho các phân tích tiếp theo. Kiểm soát chất lượng này là rất quan trọng cho nhiều ứng dụng, chẳng hạn như quy trình NGS, yêu cầu DNA chất lượng cao, hoặc phân tích biểu hiện gen, đòi hỏi RNA trong điều kiện tốt nhất. Thông thường, việc có các mẫu axit nucleic chất lượng tốt, với mức độ phân mảnh hoặc thoái hóa thấp và có số lượng lớn đủ để thực hiện cho các thí nghiệm, nghiên cứu. Trong bài viết này, chúng tôi làm rõ những yếu tố liên quan khi nói về chất lượng axit nucleic và cách xác định độ tinh sạch và tính toàn vẹn trong mẫu của bạn.

“Chất lượng” có nghĩa là gì? Xác định rõ nhu cầu của bạn

Các quy trình chuẩn bị axit nucleic cần đảm bảo chất lượng sản phẩm phù hợp cho các phân tích tiếp theo. Tuy nhiên, “chất lượng” có nhiều khía cạnh khác nhau, vì vậy chúng tôi khuyến nghị bạn nên xác định rõ yêu cầu của mình. Chất lượng axit nucleic có thể bao gồm sản lượng, tính toàn vẹn và độ tinh sạch. Sản lượng là tổng lượng axit nucleic thu được, tính bằng nồng độ DNA nhân với thể tích mẫu. Tính toàn vẹn đề cập đến mức độ nguyên vẹn của DNA/RNA, trong khi độ tinh sạch thể hiện sự vắng mặt của các tạp chất. Các yếu tố này không liên quan trực tiếp, và mỗi yếu tố có vai trò quan trọng đối với kết quả cuối cùng.

Xác định độ tinh sạch của các mẫu axit nucleic

Sau khi axit nucleic được tách chiết, các chỉ số về độ tinh sạch sẽ cung cấp thông tin về chất lượng mẫu và mức độ phù hợp của mẫu cho các ứng dụng tiếp theo. quang phổ là kỹ thuật được sử dụng phổ biến để đánh giá độ tinh sạch của axit nucleic, vì axit nucleic hấp thụ ánh sáng cực tím tại bước sóng 260nm. Nhiều chất được sử dụng trong các quy trình tách chiết DNA/RNA có thể ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ tia UV của mẫu đã tinh sạch nếu không được loại bỏ hoàn toàn trong quá trình chuẩn bị. Các chất tẩy như Triton™ X-100 và Tween® 20 thường được sử dụng trong dung dịch đệm liên kết. Các muối hỗn hợp như guanidine thiocyanate (GTC) và guanidine hydrochloride (GuHCl) là các thành phần phổ biến của dung dịch đệm liên kết. EDTA, thường có trong dung dịch đệm rửa giải DNA, có thể ảnh hưởng đến phổ hấp thụ. Ngoài ra, phenol, TRIzol™ hoặc các chất khác dùng trong quy trình tinh sạch RNA có thể tác động đến kết quả hấp thụ. Một mức độ nhất định của ethanol, được dùng trong dung dịch rửa, cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ (Hình 1 và Bảng 1).

Các chỉ số phổ biến nhất để đánh giá độ tinh sạch của mẫu là tỷ lệ hấp thụ ở 260 nm và 280 nm (A260/A280) và tỷ lệ ở 260 nm và 230 nm (A260/A230). Hai tỷ lệ hấp thụ này có thể chỉ ra sự hiện diện của các tạp chất và mức độ phù hợp của mẫu cho các ứng dụng tiếp theo. Tỷ lệ A260/A280 cung cấp thông tin về loại axit nucleic có trong mẫu (dsDNA hoặc RNA) cũng như một chỉ số sơ bộ về độ tinh sạch. Các giá trị từ 1.85 – 1.88 chỉ ra dsDNA tinh sạch; và tỷ lệ khoảng 2.1 thường được chấp nhận là RNA tinh sạch. Việc tạp nhiễm protein, phenol hoặc các chất khác liên quan đến quy trình tách chiết sẽ làm giảm tỷ lệ A260/A280 (Hình 1 và Bảng 1).

Khoảng giá trị A260/A230 yêu cầu thường nằm trong khoảng 2.3 – 2.4 đối với dsDNA và 2.1 – 2.3 đối với RNA. Nếu tỷ lệ thấp hơn so với yêu cầu, có thể do hiện diện các tạp chất hấp thụ ở 230 nm, bao gồm các muối hỗn hợp như GTC và GuHCl, EDTA, chất tẩy, protein và phenol (Bảng 1).

Các thành phần khác như các chất tẩy khác nhau (SDS), chất nhuộm (Indigo, dung dịch nạp gel), mồi, dNTP hoặc các chất kết tủa cũng có thể hiện diện trong mẫu axit nucleic. Tuy không làm thay đổi mức độ hấp thụ ở các bước sóng, nhưng có thể gây ức chế cho một số ứng dụng tiếp theo. 

Phổ hấp thụ của các tạp chất phổ biến khi có mặt cùng DNA. Một lượng DNA cố định được sử dụng cho phép đo hấp thụ (nồng độ DNA = 124,33 ng/µL). Các mẫu được bổ sung với các chất khác nhau để quan sát sự thay đổi trong biểu đồ quang phổ và tỷ lệ độ tinh sạch. Tỷ lệ hấp thụ đối với mẫu DNA tinh sạch: A260/A280 = 1,9; A260/A230 = 1,95.

Một vài thông tin và mẹo khi đánh giá độ tinh sạch:

1. RNA thường có tỷ lệ 260/280 cao hơn do tỉ lệ uracil cao hơn so với thymine.
2. Cần kiểm tra giá trị tỷ lệ độ tinh sạch và biểu đồ quang phổ hấp thụ. Một số thành phần hầu như không làm thay đổi tỷ lệ giữa 230 hoặc 280 và 260 nm, nhưng có thể gây sự khác biệt rõ rệt của đường cong biểu đồ quang phổ. Chẳng hạn, khi phenol có nồng độ cao, có thể quan sát thấy sự lệch rõ ràng về phía 270 nm và giảm nhẹ ở cả hai tỷ lệ độ tinh sạch.
3. Nồng độ của mẫu rất quan trọng khi đánh giá độ tinh sạch. Dưới 20 ng/µL, kết quả sẽ không đáng tin cậy, và từ 20 đến 50 ng/µL vẫn có độ biến động lớn, nghĩa là tính toán tỷ lệ hấp thụ chính xác nhất bắt đầu từ 50 ng/µL. Với nồng độ thấp, khuyến cáo thực hiện các thao tác đo lặp lại.
4. Mẫu axit nucleic hoàn nguyên trong nước thường không chính xác và có độ biến động cao. Tỷ lệ RNA thấp hơn từ 0,3 – 0,4 đơn vị so với các mẫu axit nucleic chứa trong đệm có tính kiềm nhẹ. Một khuyến cáo cho phân tích phổ hấp thụ là sử dụng đệm Tris.

Bảng 1. Ảnh hưởng của các tạp chất phổ biến trong mẫu axit nucleic đến tỷ lệ độ tinh khiết.

NanoDrop là một giải pháp hiệu quả cho việc đánh giá chất lượng và nồng độ của axit nucleic, đặc biệt là trong các ứng dụng nghiên cứu và phòng thí nghiệm. Công nghệ NanoDrop sử dụng phương pháp quang phổ UV-Vis để đo nồng độ và độ tinh khiết của DNA, RNA, và protein một cách nhanh chóng và chính xác. NanoDrop có thể đo nồng độ axit nucleic từ lượng mẫu rất nhỏ (chỉ cần 1-2 µL), giúp tiết kiệm mẫu và thời gian. Đặc biệt, NanoDrop không chỉ cung cấp các tỷ lệ A260/A280 và A260/A230 giúp đánh giá độ tinh khiết của mẫu mà còn có thuật toán Acclaro giúp người dùng có thể đánh giá tốt hơn về chất tạp nhiễm cụ thể có trong mẫu, đưa ra nồng độ thật sự sau hiệu chỉnh và khuyến cáo các bước xử lý tinh sạch phù hợp nhằm đảm bảo chất lượng của mẫu DNA hoặc RNA cho các ứng dụng tiếp theo như NGS, PCR, hoặc các phân tích sinh học phân tử khác.

Đánh giá độ toàn vẹn của vật liệu di truyền

Kết quả của nhiều phương pháp sàng lọc phân tử và thử nghiệm thường phụ thuộc vào độ toàn vẹn tổng thể của vật liệu axit nucleic đầu vào. DNA có độ toàn vẹn cao giúp đảm bảo kết quả chính xác trong các ứng dụng như NGS, chỉnh sửa gen, nhân bản, cũng như trong chẩn đoán trước sinh, thụ tinh trong ống nghiệm, khoa học pháp y, và nhiều lĩnh vực khác. Mẫu DNA bị phân mảnh hoặc hư hỏng có thể dẫn đến kết quả không chính xác trong các ứng dụng tiếp theo. Độ toàn vẹn RNA cũng đề cập đến sự bảo tồn của các phân tử RNA sau quá trình tách chiết. Các tách chiết RNA tổng hợp thường chứa các đơn vị rRNA, mRNA, tRNA và RNA nhỏ. RNA vốn dễ bị phân hủy bởi RNase và là một phân tử không ổn định về mặt hóa học. Nếu bạn làm việc với RNA, chất lượng là yếu tố quan trọng cho các phân tích dựa trên RNA như công nghệ microarray và RT-qPCR. Vì vậy, việc đánh giá độ toàn vẹn là điều cần thiết trong mọi trường hợp.

Trong nhiều thập kỷ, cách duy nhất để xác định sự phân mảnh và phân hủy của axit nucleic là sử dụng điện di agarose, nhưng phương pháp này có độ biến động, không chính xác và tốn thời gian. Để đánh giá mức độ phân mảnh DNA, tỷ lệ chất lượng (Q ratio) có thể được tính toán. Tỷ lệ Q được xác định bằng cách sử dụng qPCR để khuếch đại các đoạn có độ dài khác nhau: ngắn (41 bp), trung bình (129 bp) và dài (305 bp). Tỷ lệ của các đoạn này xác định tỷ lệ phân mảnh tổng thể và liên quan đến tỷ lệ phần 129 bp hoặc 305 bp so với phần 41 bp (Q129/Q41 và Q305/Q41, tương ứng). Tỷ lệ Q nên nằm trong khoảng từ 0 đến 1. Khi DNA bị phân hủy và liên kết chéo, khiến nó không khuếch đại đúng trong phản ứng PCR, số lượng các amplicon lớn sẽ ít hơn, dẫn đến tỷ lệ Q thấp hơn. Nếu DNA không bị hư hại ảnh hưởng đến PCR, sẽ có sự khuếch đại tương đương giữa các amplicon lớn và nhỏ, giúp tỷ lệ Q gần bằng 1.

Các dòng giải pháp tự động để xác định chất lượng axit nucleic đã được phát triển nhằm tiết kiệm thời gian, chi phí và vật liệu. Hiện nay, các hệ thống này bao gồm một hệ thống điện di tự động và miniaturized, được thực hiện bằng công nghệ lab-on-chip. Nó bao gồm một hệ thống vi dòng chảy, kết hợp với các thiết bị và phép đo điều khiển bằng máy tính và báo cáo phân tích dựa trên phần mềm. Các nền tảng này xác định độ toàn vẹn DNA thông qua DIN (DNA Integrity Number) và độ toàn vẹn RNA thông qua RIN (RNA Integrity Number). DIN và RIN dựa trên hệ thống đánh số từ 1 đến 10, trong đó 1 đại diện cho hồ sơ axit nucleic bị phân hủy mạnh nhất, và 10 là hồ sơ toàn vẹn nhất.