Western Blot và một số lưu ý trong nghiên cứu

Western Blot là gì?

Western Blot hay Immunoblot là kỹ thuật sử dụng các kháng thể đặc hiệt để phát hiện các protein chuyên biệt được tách chiết từ mô hoặc tế bào, dĩ nhiên mẫu cũng có thể là virus hoặc môi trường.

Nguyên lý hoạt động của Western Blot

Western Blot sử dụng kỹ thuật điện di để phân tách các protein dựa trên kích thước (SDS-PAGE 1 chiều) hoặc dựa trên cả kích thước lẫn điện tích (SDS-PAGE 2 chiều), sau đó protein sẽ được chuyển lên màng lai để gắn các kháng thể đặc hiệu. Trên kháng thể đặc hiệu có gắn phân tử phát tín hiệu, nhờ đó có thể phát hiện sự hiện diện của protein mục tiêu trên màng lai.

Quy trình thực hiện Western Blot

Tùy vào loại nguyên liệu đầu vào và tính chất của protein mục tiêu, các quy trình Western Blot có thể khác nhau ở một số bước. Tuy nhiên, có thể sơ lược quy trình Western Blot như sau:
1) Xử lý mẫu bằng cơ học hoặc enzyme để tách chiết protein mục tiêu
2) Điện di đứng mẫu đã xử lý trên gel polyacrylamide nhằm phân tách các protein trong mẫu
3) Chuyển protein đã phân tách (blotting) lên màng lai, thường là màng nitrocellulose hoặc PVDF
4) Khóa màng (blocking) bằng albumin huyết thanh bò (BSA) hoặc sữa không béo (non-fat milk) để ngăn chặn liên kết không đặc hiệu của kháng thể lên màng (gây nhiễu tín hiệu)
5) Kiểm tra protein bằng kháng thể, thông thường sẽ sử dụng 02 loại kháng thể:
– Kháng thể sơ cấp (Ab1): Kháng thể bám đặc hiệu lên protein mục tiêu
– Kháng thể thứ cấp (Ab2): Kháng thể bám đặc hiệu lên Ab1, trên Ab2 có gắn phân tử tín hiệu dạng tạo màu, phát quang hóa học hoặc phát huỳnh quang

Một số lưu ý khi thực hiện Western Blot

Xử lý mẫu

Lysis Buffer có thể sẽ khác nhau tùy vào vị trí của protein mục tiêu (protein màng, nội bào, nhân, ty thể, …). Một số trường hợp cần phải sử dụng Lysis Buffer không chứa SDS.

Quá trình xử lý mẫu nên thực hiện ở nhiệt độ thấp (khoảng 4°C) và cần bổ sung các chất ức chế protease, phosphatase để bảo vệ protein sau khi ly giải tế bào.

Có thể định lượng protein bằng 01 trong các phương pháp Bradford, Lowry, BCA hoặc đo OD 280nm. Tuy nhiên không nên sử dụng đo OD nếu cần phải định lượng chính xác.

Điện di mẫu trên gel

Chứng dương (Possitive Control): Chứng dương là protein mục tiêu, được điện di và chuyển lên màng giống như mẫu thí nghiệm để đảm bảo Western Blot không gặp sự cố, cũng như cho thấy kháng thể đang sử dụng có thể bám đặc hiệu lên protein mục tiêu.

Thang protein: Cần có thang protein để xác định kích thước protein. Bên cạnh đó, thang protein cũng giúp theo dõi quá trình điện di và quá trình chuyển protein lên màng.

Cần chuyển protein lên màng ngay sau khi hoàn tất quá trình điện di, bởi vì protein để lâu sẽ thoát ra khỏi tấm gel điện di.

Chuyển protein lên màng và nhuộm

Không được sử dụng thuốc nhuộm Coomassie vì sau khi nhuộm Coomassie sẽ không thể chuyển protein lên màng lai được, thay vào đó nên sử dụng thuốc nhuộm Copper.

Việc chuyển protein lên màng có thể thực hiện trong điều kiện ướt (wet) hoặc bán khô (semi-dry). Chuyển màng semi-dry sẽ nhanh hơn, còn chuyển màng wet ít gặp sự cố hơn và được khuyến khích sử dụng với protein có kích thước lớn (> 100 kDa).

Cần loại muối khỏi gel điện di trước khi chuyển màng để tăng hiệu quả chuyển màng, muối tồn dư có thể làm tăng độ dẫn điện và dẫn đến quá nhiệt

Khóa màng (blocking) có thể sử dụng sữa không béo hoặc BSA, tuy nhiên casein trong sữa là phospho-protein nên không được khuyến khích cho nghiên cứu phospho-protein.

Sản phẩm cho Western Blot do GeneSmart cung cấp

1) Hệ thống Western Blot – ChemiLITE ECL Western Blotting Package

chemiLITE ECL Western Blotting Workow Package là hệ thống Western Blot sử dụng tín hiệu phát quang hóa học, trang bị đầy đủ các thiết bị và hóa chất cần thiết, ngoại trừ kháng thể đặc hiệu cho protein mục tiêu (xem thêm TẠI ĐÂY). Hệ thống chụp ảnh chemLITE sử dụng Cooled CCD camera để ghi nhận tín hiệu phát quang hóa học (chemilimunescene signal) trong Western Blot.

2) Hệ thống Western Blot – ChemiPRO ECL Western Blotting Package

chemiPRO ECL Western Blotting Workow Package là hệ thống Western Blot sử dụng tín hiệu phát quang hóa học, trang bị đầy đủ các thiết bị và hóa chất cần thiết, ngoại trừ kháng thể đặc hiệu cho protein mục tiêu (xem thêm TẠI ĐÂY). Hệ thống chụp ảnh chemiPRO phù hợp phân tích sử dụng ánh sáng huỳnh quang (fluorescence), khả kiến (visible) lẫn phát quang hóa học (chemiluminescence).

Hệ thống hiện có 4 package để lựa chọn: