DNA tự do (cf-DNA) là một trong những phân tử tiềm năng lớn trong xét nghiệm chẩn đoán và theo dõi điều trị, đặc biệt là trong chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPT) và trong chẩn đoán cũng như theo dõi điều trị ung thư. Tuy nhiên, thao tác với cf-DNA cũng có nhiều vấn đề cần quan tâm, ở bài viết này Gene Smart sẽ mô tả về các lưu ý và giải pháp khi thao tác với cf-DNA.

Tổng quan về cf-DNA và ứng dụng

DNA tự do (cf-DNA) là những mảnh DNA nhỏ (150~200 bp) được tế bào phóng thích ra khi chết đi (do hoại tử hoặc apoptosis). Máu là nguồn chứa cf-DNA phổ biến nhất, tuy nhiên các dịch cơ thể khác như nước tiểu, dịch não tủy (CSF), dịch tràn màng phổi (PEF) cũng có chứa cf-DNA.

Mặc dù đã được phát hiện từ hơn 60 năm trước, cf-DNA chỉ mới nổi lên trong hơn 10 năm trở lại đây, trong đó thành công lớn nhất có thể kể đến đó là các xét nghiệm sử dụng cf-DNA đã được thương mại hóa và ứng dụng lâm sàng ở 2 lĩnh vực chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPT) và ung thư. Không chỉ có vậy, có nhiều nghiên cứu đã ứng dụng cf-DNA vào các lĩnh vực khác như đái tháo đường, bệnh tim mạch, cấy ghép mô, bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, chấn thương, …

Ở phụ nữ mang thai, thai nhi cũng phóng thích cf-DNA (gọi là fetal cf-DNA) vào máu của người mẹ. Nhờ xét nghiệm fetal cf-DNA lấy từ máu của người mẹ, có thể phát hiện bất thường di truyền ở thai nhi. Kỹ thuật như vậy được gọi là NIPT, mặc dù đã được cấp chứng nhận sử dụng trong lâm sàng (CE-IVD) từ năm 2011, có rất ít dữ liệu nghiên cứu về NIPT được công bố do hầu hết đều được phát triển bởi các công ty tư nhân.

Ở bệnh nhân ung thư, khối u cũng phóng thích cf-DNA (gọi là ct-DNA) vào máu. Tỷ lệ ct-DNA trong tổng số cf-DNA trong máu cực kỳ biến động từ 0.01 – 60%, tùy thuộc vào đặc điểm của khối u (kích thước, giai đoạn, tốc độ tăng sinh và tỷ lệ chết). Nhờ xét nghiệm ct-DNA mà có thể chẩn đoán sớm, xác định phác đồ điều trị phù hợp cũng như theo dõi hiệu quả điều trị ung thư.

Ở các loại ứng dụng khác, cf-DNA còn gặp nhiều trở ngại trên con đường đưa đến ứng dụng lâm sàng. Nguyên nhân chủ yếu đến từ việc chưa có một tiêu chuẩn chung để kiểm soát chất lượng mẫu đầu vào ở quy trình chuẩn bị mẫu trước khi đem phân tích (pre-analytical). Trong đó có 2 vấn đề chính cần được quan tâm là:

• Bệnh nhân (tuổi tác, giới tính, chủng tộc, …)
• Quy trình thu nhận, vận chuyển, xử lý và bảo quản mẫu

Các thách thức hiện tại với cf-DNA

Nghiên cứu các bộ kit xét nghiệm sử dụng cf-DNA gặp rất nhiều khó khăn, trong đó một số khó khăn chính có thể kể đến là:

1) Hàm lượng cf-DNA trong máu rất thấp (10~15 ng/mL máu)

2) Thời gian cf-DNA tồn tại trong máu là cực kỳ ngắn (half-life ~ 60 phút)

3) Máu là một loại mẫu rất phức tạp và chứa nhiều thành phần (các tế bào, các phân tử khác)

4) Sự nhiễm DNA của bộ gene (gDNA) vào trong huyết tương/huyết thanh

5) Một số nghiên cứu chỉ tập trung vào một loại cf-DNA (ct-DNA, fetal cf-DNA) chứ không phải toàn bộ cf-DNA

Các giải pháp đề xuất cho cf-DNA

Giải pháp chọn và bảo quản mẫu

Nên chọn huyết tương hay huyết thanh để tách cf-DNA?Huyết tương (plasma) và huyết thanh (serum) đều có chứa cf-DNA. Một số nghiên cứu so sánh chỉ ra cf-DNA tách được trong huyết thanh cao hơn so với huyết tương, tuy nhiên huyết thanh lại không phù hợp làm nguồn cf-DNA do dễ bị nhiễm DNA bộ gene (gDNA). Chính bước đông máu trước khi ly tâm trong quy trình tách chiết huyết thanh có thể là nguyên nhân khiến các tế bào bị ly giải và gây nhiễm gDNA vào trong mẫu.

Vì vậy, nên chọn huyết tương là nguồn tách chiết thu nhận cf-DNA. Các nội dung phía sau do đó cũng sẽ chỉ tập trung về huyết tương.

Loại ống thu nhận và bảo quản mẫu máu nào phù hợp?

Giải pháp kinh tế, bảo quản ngắn hạn

EDTA, heparin, citrate là các chất chống đông máu được sử dụng phổ biến. Tuy nhiên, heparin ức chế phản ứng PCR định lượng (qPCR) còn citrate thì vẫn còn thiếu thông tin nghiên cứu. So với heparina hay citrate thì EDTA dường như phù hợp với cf-DNA hơn, nghiên cứu chỉ ra EDTA có thể bảo quản được cf-DNA trong vòng 6 giờ. Vì vậy EDTA là phù hợp nhất trong bảo quản cf-DNA trong ngắn hạn.

Theo kết quả của một nghiên cứu, mẫu máu được bảo quản bằng EDTA tốt nhất nên được tiến hành thao tác trong vòng 2 giờ kể từ khi lấy máu tĩnh mạch, nhiệt độ bảo quản nên từ 2 – 8 ^oC. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ cao hơn (22 – 37 ^oC) sẽ làm huyết tương bị nhiễm gDNA (Bảng 1).

Giải pháp tối ưu, bảo quản dài hạn

Hạn chế lớn nhất của EDTA đó là không ngăn được sự tán huyết gây nhiễm gDNA vào trong huyết tương, bên cạnh đó thời gian bảo quản quá ngắn khiến và trong điều kiện mát khiến việc nghiên cứu cũng như ứng dụng thực tế gặp nhiều khó khăn.

Để khắc phục hạn chế của EDTA, nhiều đơn vị đã phát triển ống bảo quản cf-DNA thương mại (Bảng 1) tân tiến hơn với 3 ưu điểm chính:

• Kéo dài thời gian bảo quản cf-DNA
• Chống tán huyết và apopotosis giúp hạn chế nhiễm gDNA
• Bảo quản ở nhiệt độ phòng (15 – 30^oC) thậm chí chịu được nhiệt độ cao (37^oC)

Điều quan trọng trong bảo quản cf-DNA là trong quá trình vận chuyển cần tránh các rung động mạnh (shake) khiến mẫu bị tán huyết và gây nhiễm cf-DNA, bên cạnh đó một số ống vận chuyển sẽ bị hao hụt thể tích huyết tương sau quá trình vận chuyển. Vì vậy, cần cân nhắc hiệu quả chống hao hụt thể tích huyết tươngsau vận chuyển của các ống bảo quản cf-DNA để đảm bảo lượng huyết tương thu nhận đủ để thực hiện các xét nghiệm như NIPT hay ung thư.

Bảng 1. Thông tin một số ống bảo quản cf-DNA

Ống bảo quản	Hãng sản xuất	Điều kiện bảo quản đối với cf-DNA
EDTA tube		– Ở nhiệt độ 2-8 oC: 6 giờ
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tube		– Ở nhiệt độ phòng: 30 ngày – Ở nhiệt độ cao 37 oC: 8 ngày
Cell-free DNA BCT		– Ở nhiệt độ phòng: 14 ngày – Ở nhiệt độ cao 37 oC: 4 ngày
Cell-free DNA Collection Tube		– Ở nhiệt độ phòng: 7 ngày – Ở nhiệt độ cao 30 oC: 16 giờ
PAXgene Blood ccf DNA Tube		– Ở nhiệt độ phòng: 10 ngày – Ở nhiệt độ cao 37 oC: 3 ngày

Chuẩn bị huyết tương: Tách chiết huyết tương

Có 2 phương pháp tách chiết huyết tương phổ biến là ly tâm 1 bước và ly tâm 2 bước. Page và cộng sự đã chứng minh rằng ly tâm 2 bước giúp giảm thiểu lượng DNA tạp nhiễm (> 300 bp) trong mẫu, và vì vậy giải pháp tốt nhất để hạn chế nhiễm gDNA là tách huyết tương theo quy trình ly tâm 2 bước (Hình 2):

– Bước 1: Ly tâm chậm (1,200 ~ 3,000 g) trong 10 phút, vận tốc này đủ để làm lắng đồng thời vẫn giữ các tế bào máu nguyên vẹn.

– Bước 2: Ly tâm nhanh (10,000 ~ 16,000 g) trong 10 phút, sau khi đã lắng các tế bào việc tiến hành ly tâm vận tốc cao sẽ giúp làm lắng các bào quan và mảnh vụn còn xót lại trong huyết tương.

Quá trình ly tâm có thể thực hiện ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên sẽ tốt hơn nếu được thực hiện ở 4 ^oC. Sau khi ly tâm cần phải thật cẩn thận, dùng pipette hút dịch huyết tương phía trên đồng thời tránh làm động lớp màng ngăn (buffy coat) giữa huyết tương và tế bào máu.