Trong suốt thập kỷ qua, ngành công nghiệp chỉ thị sinh học đối mặt với nhiều thách thức: thời gian cần nhanh hơn để tái sử dụng sớm dụng cụ tiệt trùng, sự phát triển các dụng cụ y tế với chất liệu và cấu tạo mới, sự xuất triển các quy trình tiệt trùng mới, cũng như các nhu cầu mới về các chỉ số cần kiểm soát cho quy trình tiệt trùng. Với các yêu cầu này, chỉ thị sinh học SCBI đọc kết quả nhanh dựa trên tín hiệu huỳnh quang.

Huỳnh quang là một hiện tượng phát sáng ngắn hạn, không thể nhận biết bằng mắt, thông qua các cơ chất có khả năng hấp thụ năng lượng  và sau đó phát ra ánh sáng với tần số nhỏ hơn gọi là phát huỳnh quang. Mỗi phân tử huỳnh quang có thể hấp thụ và phát quang năng lượng với một số đặc điểm nhất định, cho phép kích thích và phát hiện chúng thông qua các bộ lọc và cảm biến đặc biệt. (Hình 1)

Hệ thống phát hiện huỳnh quang dựa trên sự hoạt động của một enzyme được tìm thấy ở bào tử. Enzyme này sẽ xuất hiện trong thời gian bào tử tiếp xúc với môi trường nuôi cấy (bào tử ngậm nước và nảy mầm). Vào thời điểm đó, enzyme sẽ bắt đầu phản ứng với cơ chất huỳnh quang ở trong môi trường nuôi cấy.

Quá trình xảy ra sau đó kể từ khi enzyme và cơ chất tiếp xúc nhau xác định cách chỉ thị sinh học hoạt động và được mô tả bởi phản ứng động học. Nói theo một cách khác, sự xuất hiện, ổn định và sau đó biến mất của tín hiệu huỳnh quang phụ thuộc vào enzyme động học (Hình 2)

Phản ứng enzyme là quá trình động, nên không thể biết chính xác thời điểm tín hiệu huỳnh quang xuất hiện. Thời điểm xuất hiện và cường độ huỳnh quang sẽ phụ thuộc vào: số lượng enzyme có sẵn đang hoạt động sau quá trình tiệt trùng, trạng thái môi trường tăng sinh sau khi tiếp xúc bào tử, nhiệt độ ủ, và các yếu tố khác. Do đó, để phát hiện huỳnh quang trong thời gian ngắn nhất và để xác định xem kết quả là dương tính hay âm tính, nên đo tín hiệu huỳnh quang trong suốt quá trình ủ và lấy giá trị tương đối với giá trị tham chiếu. Có nghĩa là, các phép đo tương ứng với sự khác biệt giữa giá trị đo và giá trị tham chiếu (sẽ khác nhau với các BI khác nhau). Khi sự khác biệt lớn hơn giá trị tham chiếu được xác định trước đó, kết quả là dương tính và ngược lại (điều này sẽ xảy ra trong suốt quá trình ủ).

Đường cong tín hiệu huỳnh quang BI bao gồm 4 pha được xác định dựa trên tín hiệu phát quang trong trường hợp bào tử còn sống sau khi tiệt trùng.

Nếu bào tử chết hoàn toàn, sẽ không có sự nảy mầm và tăng trưởng=> không có enzyme và không có hoạt động huỳnh quang=> Kết quả âm tính và lô tiệt trùng đạt yêu cầu.

Giai đoạn đầu hoặc trễ hơn (initial), là thời gian bào tử tiếp xúc với môi trường nuôi cấy cũng như các điều kiện thuận lợi khác. Giai đoạn này chưa có huỳnh quang vì chưa có enzyme. Đây cũng là lí do tại sao các BI cần thời gian ủ tối thiểu. Ở giai đoạn này, giá trị tham chiếu sẽ được tạo để thực hiện việc so sánh về sau.

Giai đoạn tuyến tính (linear), tốc độ phản ứng là cao nhất vì enzyme được tạo ra tiếp xúc với các cơ chất trong môi trường, tạo ra sự gia tăng huỳnh quang đáng kể (∆F>0). Giai đoạn này máy đọc tự động sẽ ghi nhận huỳnh quang, phát hiện sự khác biệt và cho ra kết quả dương tính.

Trong giai đoạn bão hòa hoặc đứng yên (saturation hoặc stationary), không có thêm sự hoạt động của enzyme vì tất cả các enzyme đã phản ứng với chất nền trước đó, do đó không có sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang (∆F<0). Nếu một BI được ủ và đọc kết quả trong giai đoạn này (VD: ủ và đọc lại BI) thì kết quả sẽ là âm tính (ngay cả khi lần đọc trước đó kết quả dương tính, vì giữa hai lần đọc ủ giá trị tham chiếu khác nhau).

Trong giai đoạn ức chế hoặc suy thoái (inhibition hoặc decline), tín hiệu huỳnh quang giảm tuyến tính vì chất nền bắt đầu cạn kiệt/hoặc hiện tượng ức chế khi dư thừa sản phẩm (∆F<0). Nếu đọc và ủ ở giai đoạn này, kết quả là âm tính.

Vì vậy, trong mọi trường hợp không nên ủ và đọc lại chỉ thị sinh học dựa trên tín hiệu huỳnh quang. Các chỉ thị sinh học huỳnh quang cần được ủ và đọc kết quả ngay lập tức sau khi hoạt hóa (khi cho môi trường tiếp xúc với bào tử).

Nếu sau khi tiệt trùng và không có thời gian ủ ngay, có thể giữ lại chỉ thị sinh học và không hoạt hóa đến khi sẵn sàng.

Tài liệu tham khảo: https://www.terragene.com.ar/wp-content/uploads/Re-incubaci%C3%B3n-de-IBs-Rev.0-INGLES-links.pdf