Định lượng axit nucleic là một bước quan trọng trong quá trình chuẩn bị mẫu giúp đảm bảo hiệu suất tối ưu của các xét nghiệm tiếp theo. Một quan niệm sai lầm phổ biến là tất cả các phương pháp định lượng đều giống nhau và có độ chính xác tương tự. Nhưng trên thực tế, ước tính nồng độ có thể khác nhau tùy thuộc vào phương pháp được sử dụng.

Vì vậy, điều quan trọng là phải hiểu cơ sở của từng phương pháp để bạn có thể chọn phương pháp phù hợp nhất với nhu cầu của mình. Bài viết này mô tả các nguyên tắc, ưu điểm và hạn chế của ba phương pháp phổ biến nhất để định lượng DNA hoặc RNA: đo quang phổ, huỳnh quang và real-time PCR.

Bảng so sánh tóm tắt các phương pháp phù hợp để định lượng axit nucleic

Về các phương pháp định lượng axit nucleic

Với phát triển không ngừng của công nghệ, sự tiến triển của dự án nghiên cứu genomics hiện nay không gặp giới hạn bởi công nghệ sinh học phân tử mà bởi câu hỏi nghiên cứu của dự án. Tiến bộ trong các ứng dụng như phân tích kiểu gen, phân tích biểu hiện gen, phát hiện dấu ấn sinh học, lập hồ sơ ung thư tế bào và phân tử, đã được nâng cao nhờ những cải tiến liên tục trong các công nghệ như qPCR, microarrays và giải trình tự.

Trong quy trình chuẩn bị mẫu, có nhiều yếu tố gây nhiễu có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và độ tái lập của các thí nghiệm phía sau. Trong quá trình từ việc thu mẫu cho đến tách chiết axit nucleic và kiểm soát chất lượng, nhiều sự biến đổi có thể xảy ra. Bài viết này sẽ đi tập trung vào một khía cạnh vô cùng quan trọng trong việc kiểm soát chất lượng: định lượng axit nucleic.

Kết quả từ các kĩ thuật được ứng dụng phổ biến, chẳng hạn như real-time PCR, có thể khó tái tạo, gây khó khăn cho việc đưa ra kết luận từ một thí nghiệm cụ thể. Việc định lượng mẫu axit nucleic rất quan trọng để mang lại kết quả thành công:

• Đảm bảo khuếch đại tuyến tính: Phản ứng real-time PCR  yêu cầu sự cân bằng về tỉ lệ  giữa mẫu axit nucleic, mồi, đầu dò và các thành phần hỗn hợp khác cùng với các thông số chu trình. Định lượng axit nucleic chính xác đảm bảo khuếch đại tuyến tính của các bộ khuếch đại mục tiêu đồng thời giảm thiểu các thành phần không đặc hiệu và gây cản trở quá trình khuếch đại như primer dimer (hiện tượng mồi tự bắt cặp) (1).
• Xem xét các chất ức chế quá trình khuếch đại:Hiệu quả tách chiết axit nucleic và độ tinh khiết của mẫu phụ thuộc vào nhiều yếu tố, chẳng hạn như loại mẫu và phương pháp tách chiết. Trong nhiều trường hợp, các chất gây nhiễm cùng tồn tại song song với axit nucleic trong quá trình tách chiết và chúng có thể hoạt động như các chất ức chế quá trình khuếch đại. Việc định lượng mẫu của bạn rất quan trọng vì các mẫu có nồng độ template cao nhất cũng chứa nhiều chất ức chế nhất, điều này có thể dẫn đến sự chậm trễ của Cq. Ngược lại, các mẫu có nồng độ template thấp hơn thì mức độ chất ức chế cũng ít hơn, do đó, sự chậm trễ của Cq là không đáng kể.
• Chuẩn hóa mẫu cho các ứng dụng nghiên cứu biểu hiện gen: Khi so sánh biểu hiện gen, gen mục tiêu phải được chuẩn hóa thành một hoặc nhiều gen tham chiếu. Việc định lượng axit nucleic đảm bảo cùng một lượng mẫu chứng và mẫu cần đo được chạy song song (2).
• Đảm bảo đủ đầu vào RNA: Đối với các kỹ thuật phân tử sử dụng cDNA, các vấn đề về khả năng tái tạo có thể là do sự thay đổi về lượng RNA được sử dụng trong bước RT (3). Tương tự, với việc giải trình tự thế hệ tiếp theo, đầu vào mRNA thấp có thể dẫn đến tính biến đổi do khuếch đại không hiệu quả. Sự khuếch đại không hiệu quả của các bản sao phiên mã được biểu hiện ở mức thấp đến vừa phải có thể bỏ qua những khác biệt sinh học nhỏ (4). Định lượng RNA trước khi khuếch đại là rất quan trọng để đảm bảo rằng đủ lượng RNA được sử dụng trong thí nghiệm.

 Phương pháp định lượng axit nucleic

Có một số kỹ thuật phòng thí nghiệm phổ biến được sử dụng để ước tính nồng độ mẫu axit nucleic. Tuy nhiên, một quan niệm sai lầm phổ biến là tất cả các phương pháp này đều có độ chính xác tương tự hoặc thậm chí đo cùng một thứ: lượng DNA hoặc RNA có trong mẫu. Trên thực tế, mỗi phương pháp đo một thứ khác nhau. Tùy thuộc vào phương pháp bạn chọn, sự gây nhiễu hoặc các vấn đề khác có thể dẫn đến ước tính nồng độ không nhất quán.

Phép Đo Quang Phổ UV-Vis

Phép đo UV-Vis đã trở thành một phương pháp phổ biến và tiêu chuẩn trong việc định lượng DNA, RNA, và protein trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý rằng các phân tử sinh học này hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng đặc trưng. Ví dụ, DNA và RNA hấp thụ  tối đa ánh sáng cực tím (UV) ở bước sóng 260nm (λmax = 260nm), trong khi protein thường được đo ở 280 nm. 

Phép đo UV-Vis hoạt động dựa trên định luật Beer-Lambert- nêu sự liên hệ giữa việc hấp thụ ánh sáng với các đặc tính của vật liệu mà ánh sáng đi qua. Định luật này nêu rằng có sự phụ thuộc logarit giữa sự truyền ánh sáng qua một chất và tích của hệ số hấp thụ của chất đó và độ dài đường truyền ánh sáng (Hình 1).

A = ε × c × l
Định luật Beer-Lambert có thể được sử dụng với các hệ số hấp thụ phân tử thích hợp để xác định nồng độ axit nucleic.

Định luật Beer-Lambert

Đối với hầu hết các thiết bị thương mại, các phép đo định lượng quang phổ (A260) đáng tin cậy nằm trong khoảng từ 0,1 đến 1,5. Đặc biệt, thiết bị NanoDrop đã mang lại bước đột phá trong quy trình này bằng cách cho phép đo trực tiếp trên một lượng mẫu rất nhỏ (chỉ khoảng 1-2 µl) mà không cần sử dụng cuvet truyền thống. Sự tiện lợi, tốc độ và khả năng đo đa dạng các loại mẫu đã biến NanoDrop thành lựa chọn hàng đầu cho các nhà nghiên cứu cần xác định nồng độ và độ tinh khiết của các mẫu sinh học một cách nhanh chóng và chính xác.

Đối với máy quang phổ có chiều dài đường truyền 1 cm, khoảng nồng độ lý thuyết của DNA dao động từ 5–75 ng/µl. Với thiết bị NanoDrop®-2000, có chiều dài đường truyền chỉ 0,05 mm (0,005 cm), khoảng nồng độ DNA có thể đo được mở rộng từ 2–15.000 ng/µl. Mặc dù phạm vi này cho phép phát hiện một dải nồng độ dsDNA rộng, giới hạn dưới của khoảng nồng độ (2 ng/µl) vẫn được phát hiện và định lượng với độ nhạy thấp hơn.

Một vấn đề khác cần lưu ý khi sử dụng phương pháp đo quang phổ UV là không chỉ có axit nucleic, mà một số chất gây nhiễu phổ biến khác cũng hấp thụ mạnh ở bước sóng gần 260 nm. Hơn nữa, phương pháp này khó phân biệt được giữa dsDNA, ssDNA, RNA, các nucleotide tự do và các đoạn mồi nếu chúng cùng tồn tại trong mẫu.

Đặc biệt, thiết bị NanoDrop đã cách mạng hóa quy trình này bằng cách cho phép đo lường trực tiếp trên một lượng mẫu rất nhỏ (chỉ khoảng 1-2 µl) mà không cần sử dụng cuvettes truyền thống. Bên cạnh đó, NanoDrop cũng cung cấp dòng máy NanoDrop Eight để tăng thông lượng đo 8 mẫu cùng lúc, đáp ứng nhu cầu cho các kỹ thuật như microarrays – yêu cầu đo 96 mẫu trong 1 lần. Sự tiện lợi, tốc độ và khả năng đo đa dạng loại mẫu đã làm cho NanoDrop trở thành lựa chọn không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử cần xác định nồng độ và độ tinh khiết của các mẫu sinh học một cách nhanh chóng và chính xác.

Hình 1. Máy NanoDrop Eight của Thermo Scientific

Máy quang phổ huỳnh quang (Fluorescence) 

Fluorometry, còn được gọi là spectrofluorometry (gọi tắt là máy quang phổ huỳnh quang) là một loại quang phổ điện từ khác phân tích ánh sáng phát ra từ các phân tử huỳnh quang gọi là fluorophore. Fluorophore phản ứng rõ rệt với ánh sáng so với các phân tử khác. Khi một photon của ánh sáng kích thích được hấp thụ bởi một electron của fluorophore, mức năng lượng của electron tăng lên trạng thái kích thích. Trong thời gian kích thích ngắn, một phần năng lượng bị tiêu tán và năng lượng còn lại được phát ra dưới dạng photon để đưa electron trở lại trạng thái cơ bản. Vì photon phát ra thường mang ít năng lượng hơn và do đó có bước sóng dài hơn photon kích thích, nên huỳnh quang phát ra có thể được phân biệt với ánh sáng kích thích bằng máy đo huỳnh quang (Hình 2).

Hình 2. Nguyên lý hoạt động của việc sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang trong việc đo lường axit nucleic. Hình trên. Nguyên tắc vật lý cơ bản của thuốc nhuộm huỳnh quang Hình dưới. Phổ kích thích và phát xạ của thuốc nhuộm dsDNA QuantiFluor®.

Các phương pháp định lượng dựa trên thuốc nhuộm huỳnh quang tận dụng cơ chế này bằng cách sử dụng các phân tử thuốc nhuộm được thiết kế để ưu tiên liên kết với một loại axit nucleic nhất định. Chẳng hạn, khi một loại thuốc nhuộm liên kết với DNA sợi đôi (dsDNA) được kích thích bởi một bước sóng ánh sáng cụ thể, chỉ các phân tử thuốc nhuộm ở trạng thái đã liên kết với dsDNA mới phát huỳnh quang. Khi thuốc nhuộm liên kết với axit nucleic mục tiêu, hiệu suất huỳnh quang tăng lên dựa trên sự thay đổi trong cấu hình phân tử của chất phát huỳnh quang. Đặc điểm này của kỹ thuật định lượng huỳnh quang, kết hợp với sự ưu tiên liên kết giữa thuốc nhuộm và mục tiêu, dẫn đến tín hiệu nền thấp, độ chính xác và đặc hiệu cao, khiến nó trở nên lý tưởng cho việc định lượng các mẫu axit nucleic có nồng độ thấp (Hình 4).

Để phương pháp này mang tính định lượng, một chất chuẩn có nồng độ đã biết được đem đi pha loãng để tạo đường chuẩn. Một máy đo huỳnh quang được sử dụng để đọc và ghi lại các đơn vị biến thiên cường độ huỳnh quang (RFU) cho mỗi điểm của đường cong. Những dữ liệu này sẽ tạo thành một đường hồi quy có phương trình (y = mx + b) hoặc lũy thừa (y = axb) để tính toán nồng độ của bất kỳ mẫu nào chưa biết. Như vậy, so với máy đo quang phổ UV-Vis, phương pháp đo huỳnh quang fluorescence cải thiện độ đặc hiệu và độ chính xác nhờ vào ưu điểm ít bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác trong quá trình đo (hình 3).

Hình 3. Nồng độ DNA tách chiết từ 2 nhóm- Feline và Equine được đo bằng cả kỹ thuật quang phổ UV (NanoDrop®) và huỳnh quang (QuantiFluor® Dye) trước khi giải trình tự metagenomics 16s.

Real-Time PCR (qPCR)

Real-time PCR (qPCR) là một kĩ thuật dựa vào chu trình nhiệt để khuếch đại mạch khuôn DNA bằng DNA polymerase. Sau n vòng tuần hoàn nhiệt, tổng cộng 2n sản phẩm PCR được hình thành. Các thiết bị phát hiện đo sự tích tụ của sản phẩm DNA sau mỗi vòng khuếch đại PCR bằng cách sử dụng các reporters huỳnh quang. Các reporters này có thể là thuốc nhuộm như SYBR® green hoặc các đầu dò như TaqMan®. RNA có thể được đo bằng cùng một quy trình sau bước phiên mã ngược (RT) sơ bộ chuyển đổi nó thành cDNA.

Dữ liệu chính từ một thí nghiệm real-time PCR là một đường cong khuếch đại, thể hiện tín hiệu huỳnh quang bằng đơn vị thể hiện độ biến thiên cường độ huỳnh quang (RFU) so với số chu kỳ và biểu đồ sự tích lũy của sản phẩm khuếch đại. Đường nền (baseline) được đo trong giai đoạn đầu của quá trình khuếch đại, trước khi thiết bị có thể phát hiện sự hình thành sản phẩm. Khi sản phẩm tích lũy, nó đạt đến một điểm mà tại đó thiết bị có thể phát hiện sự thay đổi tín hiệu so với mức nền.

Ngưỡng phát hiện (detection threshold) là mức độ huỳnh quang mà tại đó sự tích lũy của tín hiệu đặc hiệu có thể được phân biệt với tín hiệu nền. Ngưỡng này được thiết lập tự động cao hơn đường nền, nằm ở đầu vùng nhân bản theo phần mũ của đường cong khuếch đại. Số chu kỳ mà tại đó sản phẩm khuếch đại vượt qua ngưỡng phát hiện đó được gọi là chu kỳ định lượng (Cq) (Hình 4).

Hình 4. Kết quả real-time PCR cho thấy mối quan hệ giữa tín hiệu nền (baseline), ngưỡng phát hiện và giá trị Cq (chu kỳ ngưỡng)

Hơn nữa, tương tự với phương pháp đo quang phổ huỳnh quang, chúng ta có thể dựng đường chuẩn để xác định nồng độ của mẫu chưa biết (được tính toán từ số chu kỳ ngưỡng Cq) (hình 5).

Hình 5. Đường chuẩn của real-time PCR. Chu kì ngưỡng (giá trị Cq) của các chất chuẩn được chuẩn độ được minh họa tương quan với nồng độ của chúng

Phương pháp real-time PCR cung cấp khả năng phát hiện với độ nhạy cao, thậm chí với lượng nhỏ tới mức picogram của axit nucleic cũng như có khả năng định lượng chính xác nhóm axit nucleic quan tâm cụ thể, ngay cả khi có sự xuất hiện các axit nucleic , các đoạn mồi, và các nucleotide tự do.

Nguồn tham khảo

1. Bustin S.A. et al. (2009) The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55, 611–22.
2. Huggett J. et al. (2005) Real-time RT-PCR normalization; strategies and considerations. Genes and Immunity. 6, 279-284.
3. Bustin S.A. et al. (2015) Variability of the Reverse Transcription Step: Practical Implications. Clin. Chem. 61, 1.
4. Bhargava V. et al. (2014) Technical variations in low-input RNA-seq methodologies. Sci. Rep. 4, 3678.
5. Promega Corporation. (2018). Choosing the right method for nucleic acid quantitation. Promega PubHub.