Các thiết bị NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) thường được sử dụng để định lượng các phân tử acid nucleic, bao gồm oligonucleotide DNA, DNA sợi đôi và RNA. Đặc biệt, khi định lượng oligonucleotide, cần lưu ý những đặc điểm của chúng, điều này có thể yêu cầu điều chỉnh các thông số của NanoDrop để có được kết quả chính xác nhất.

Dưới đây là tóm tắt các điều chỉnh được khuyến cáo khi sử dụng thiết bị NanoDrop để định lượng oligonucleotide.

Sử dụng hệ số chuyển đổi đặc thù cho oligo thay vì hệ số chuyển đổi chung cho DNA sợi đơn (ssDNA) là 33 μg/A260 trong máy NanoDrop

Oligonucleotide là những phân tử ngắn, sợi đơn. Phổ UV và hệ số hấp thụ của chúng phụ thuộc nhiều hơn vào thành phần bazơ và trình tự của chúng so với các phân tử DNA sợi đơn và RNA sợi đơn dài hơn. Do đó, để định lượng, bạn nên xác định và áp dụng hệ số chuyển đổi đặc thù cho oligo. Phần mềm NanoDrop sẽ tự động thực hiện điều này khi bạn chọn tùy chọn “custom” hoặc “oligo” từ menu.

Sử dụng tính năng đo MicroArray của phần mềm NanoDrop để đo các oligonucleotide có sự biến đổi ở hai đầu

Nhiều biến đổi được thêm vào đầu 5′ hoặc 3′ của oligonucleotide có khả năng hấp thụ ánh sáng, do đó có thể ảnh hưởng đến kết quả định lượng. Để định lượng các oligonucleotide đã được biến đổi, bạn nên sử dụng một hệ số điều chỉnh. Để có được giá trị này với phần mềm NanoDrop, hãy sử dụng tính năng đo MicroArray, cung cấp khả năng điều chỉnh tự động cho sự hấp thụ của các biến đổi.

Thực hiện pha loãng để đảm bảo các phép đo hấp thụ sử dụng chiều dài đường quang 1 mm hoặc 0.2 mm

Sử dụng nhiều chiều dài đường quang, các thiết bị NanoDrop có thể đo phạm vi nồng độ rộng của acid nucleic. Tuy nhiên, sai số chấp nhận được của thiết bị tăng lên khi chiều dài đường quang bị rút ngắn. Kết quả định lượng chính xác nhất có thể đạt được bằng cách đo các oligonucleotide đã được pha loãng với độ hấp thụ <12.5. Điều này sẽ giúp đảm bảo thiết bị thực hiện các phép đo hấp thụ tại chiều dài đường quang 1 mm hoặc 0.2 mm, cung cấp độ dung sai sai số nhỏ hơn.

Xác định độ hấp thụ xấp xỉ của dung dịch stock oligonucleotide bằng phương trình Beer-Lambert:

A = ε. c. l

Trong đó: 

• A: Độ hấp thụ
• ε: Hệ số hấp thụ phân tử của chất ở bước sóng đó (một hằng số đặc trưng cho từng loại phân tử) (L/(mole·cm)
• c:  Nồng độ của chất trong dung dịch (M, mole/L)
• l: Chiều dài đường quang (cm)

Tắt chức năng hiệu chỉnh cơ bản mặc định cho các oligonucleotide có sự biến đổi hấp thụ ánh sáng ở 340 nm

Cài đặt mặc định của các phép đo thiết bị NanoDrop là 340 nm. Chức năng hiệu chỉnh cơ bản này cần thiết vì nó điều chỉnh sự tán xạ ánh sáng có thể làm sai lệch kết quả. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng một số biến đổi của oligonucleotide hấp thụ ánh sáng ở bước sóng này, vì vậy chức năng hiệu chỉnh cơ bản này cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả của bạn.

Hướng dẫn tắt tính năng: vào Settings thiết bị -> Chọn ON/OFF tính năng baseline correction

Cũng cần lưu ý rằng các tỷ lệ chỉ độ tinh sạch thông thường như A260/280 và A260/230, sẽ không áp dụng cho oligonucleotide, vì hình dạng của phổ UV của oligonucleotide phụ thuộc nhiều vào thành phần bazơ.

Tài liệu tham khảo

• Cavaluzzi MJ, Borer PN. Revised UV extinction coefficients for nucleoside-5′-monophosphates and unpaired DNA and RNA. Nucleic Acids Res. 2004;32(1):e13.
• Desjardins P, Conklin D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. 2010(45).
• Reule AG. Errors in Spectrophotometry and Calibration Procedures to Avoid Them. J Res Natl Bur Stand A Phys Chem. 1976;80A(4):609-624.
• He HJ, Stein EV, DeRose P, et al. Limitations of methods for measuring the concentration of human genomic DNA and oligonucleotide samples. Biotechniques. 2018;64(2):59-68.