Sinh thiết khối u là phương pháp chuẩn trong xét nghiệm chẩn đoán và xét nghiệm phân tử để đưa ra phác đồ điều trị ung thư. Tuy nhiên sinh thiết lỏng, đặc biệt là những mẫu có chứa DNA tự do (cf-DNA) như huyết tương đang nổi lên nhanh chóng, trở thành một xét nghiệm bổ sung ít xâm lấn hơn, thậm chí đây còn được xem là phương pháp thay thế đầy tiềm năng.

Sinh thiết lỏng & DNA tự do (cf-DNA) là gì?

Sinh thiết lỏng, khi nhắc đến cụm từ này có lẽ ai cũng nghĩ đến máu, thực tế “sinh thiết lỏng” không chỉ có máu mà còn ám chỉ các loại dịch khác trên cơ thể như nước tiểu, phân, dịch não tủy (CSF), nước bọt, dịch màng phổi, và cả cổ trướng (ascites). Tất cả các sinh thiết lỏng đều là nguồn mẫu tiềm năng để phát hiện các thành phần có nguồn gốc từ khối u, trong đó có DNA tự do (cf-DNA).

Bài viết này tập trung vào ứng dụng cf-DNA đến từ mẫu máu, tuy nhiên cf-DNA từ các nguồn khác cũng có những ứng dụng riêng, chẳng hạn như với ung thư não thì cần sử dụng mẫu dịch não tủy, ung thư đại trực tràng cần sử dụng mẫu phân, ung thư ở đầu hay cổ thì lại sử dụng mẫu nước bọt, … (xem Hình 2)

DNA tự do (cf-DNA), thuật ngữ này ám chỉ những mảnh DNA nhỏ hiện diện trong máu, được ghi nhận lần đầu bởi Mandel và Metais vào năm 1948. Chúng thường được phát hiện dưới dạng DNA mạch đôi và có kích thước khoảng 150 – 200 cặp base, cũng tương ứng độ dài của 1 nucleosome. Người ta cho rằng cf-DNA được phóng thích vào máu thông qua quá trình chết theo chương trình (apoptosis) hoặc do hoại tử. Thời gian tồn tại của cf-DNA trong hệ tuần hoàn cũng không lâu, chu kỳ bán rã của chúng chỉ khoảng 1 giờ đồng hồ hoặc có thể ngắn hơn.

Trong cơ thể người khỏe mạnh, cf-DNA hiện diện trong huyết tương ở mức thấp khoảng 10 – 15 ng/mL và sẽ tăng khi mô gặp căng thẳng như tập thể dục, viêm, phẫu thuật hay chấn thương. Ở bệnh nhân ung thư, tế bào khối u phóng thích ra một lượng cf-DNA và được đặt tên là “DNA khối u tuần hoàn” (ct-DNA), những ct-DNA làm cho hàm lượng cf-DNA ở bệnh nhân ung thư thường cao hơn người khỏe mạnh. Tuy nhiên tỷ lệ ct-DNA giữa các loại ung thư khác nhau, thậm chí là giữa các bệnh nhân mang cùng một loại ung thư cực kỳ biến động, tỷ lệ ct-DNA/cf-DNA đo được có người thì ≤ 0.1% nhưng cũng có người lại ≥ 90%, điều này gây thách thức đáng kể cho việc phân tích ct-DNA trên nền tảng cf-DNA.

Tách chiết và phân tích DNA tự do (cf-DNA)

Do cf-DNA hiện diện ở mức thấp và chu kỳ bán rã lại ngắn, vậy nên cần phải có phương pháp chuyên biệt để tách chiết lẫn phân tích cf-DNA. Hai vấn đề chính là tính ổn định của cf-DNA và sự tán huyết làm mẫu nhiễm các DNA khác, để hạn chế những vấn đề trên mẫu máu lấy từ tĩnh mạch cần được chứa trong ống bảo quản mẫu máu chuẩn, còn huyết tương phải được ly tâm và phân lập trong vòng 1-4 giờ tính từ lúc lấy máu.

Yêu cầu về xử lý nhanh tạo ra thách thức do sự biến động về nồng độ cũng như độ tinh sạch của cf-DNA khi xử lý trong khoảng thời gian khác nhau. Để khắc phục khó khăn đó, một số loại ống bảo quản mẫu máu chuyên dụng dành cho cf-DNA (xem Hình 1) đã ra đời, các ống này có chứa chất đệm cho phép giữ ổn định cf-DNA lẫn tế bào nguyên vẹn trong vòng 7-14 ngày ở nhiệt độ phòng, điều này giúp dễ vận chuyển, bảo quản, xử lý theo đợt một cách đồng bộ.

Tỷ lệ ct-DNA/cf-DNA thường thấp và khác nhau các bệnh nhân vì vậy cần có những phương pháp siêu nhạy để phát hiện các allele đột biến ở tần suất thấp (Hình 3). Để phát hiện đột biến điểm có thể sử dụng các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR, chẳng hạn như BEAMing hay PCR vi giọt kỹ thuật số (ddPCR) có thể phát hiện sự thay đổi allele hiện diện ở tần suất 0.01%. Kỹ thuật giải trình tự NGS cũng có thể điều chỉnh cho phù hợp, từ giải toàn bộ bộ gene thành nhắm trúng đích đến một hoặc một vài gene mục tiêu (deep sequencing) để giảm phụ thuộc vào tỷ lệ sai xót của enzyme DNA polymerase.

Ứng dụng lâm sàng

Phân tích DNA khối u bằng việc lấy máu định kỳ mà không cần phải làm sinh thiết khối u là một bước tiến lớn trong ứng dụng lâm sàng, đặc biệt là đối với những trường hợp khối u khó xác định vị trí, khối u khó thu mẫu (xem Bảng 1). Hơn nữa, việc theo dõi điều trị cũng sẽ dễ dàng hơn và dĩ nhiên việc lấy một mẫu đại diện để phát hiện được nhiều dòng tế bào khối u khác nhau thì tiện hơn là dùng kim chọc sinh thiết từng khối u. Ngoài ra, lấy máu còn có thể giúp phát hiện và theo dõi những bệnh nhân không có dấu hiệu bệnh lý lâm sàng.

Chẩn đoán và hồ sơ phân tử

Hồ sơ phân tử khối u là nền tảng để lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp trong ung thư, nhờ cf-DNA mà việc xây dựng hồ sơ phân tử khối u được đơn giản hóa thông qua việc lấy máu.

Tuy nhiên câu hỏi được nhiều nhà khoa học đặt ra là “Liệu hồ sơ các đột biến từ xét nghiệm cf-DNA có đáng tin cậy như xét nghiệm sinh thiết khối u hay không?”

Các nghiên cứu chứng minh cũng gặp nhiều khó khăn do nhiều mẫu thu nhận không ở điều kiện lý tưởng, chẳng hạn như bệnh nhân đang được điều trị khiến cho ct-DNA luôn ở mức thấp nên rất khó để xác định sự thay đổi. Bên cạnh đó là khi cf-DNA ở mức thấp sẽ thường đi kèm với tình trạng “dương tính giả” và “âm tính giả” làm ảnh hưởng đến số liệu nghiên cứu.

Dù vậy, xét nghiệm cf-DNA vẫn có vai trò quan trọng trong xét nghiệm ban đầu, nhất là với những bệnh nhân mà khối u nhỏ khiến lượng sinh thiết khối u không đủ để làm các xét nghiệm giải trình tự.

Khi cần lặp lại xét nghiệm nhiều lần, đặc biệt là để theo dõi điều trị thì phân tích cf-DNA mang lại nhiều lợi thế rất rõ ràng: ít xâm lấn hơn, an toàn hơn, và chi phí lại rẻ hơn. Đặc biệt là lợi thế trong phát hiện sự thay đổi tính kháng thuốc của khối u và có thể đưa ra liệu trình mới phù hợp hơn.

Theo dõi đáp ứng điều trị

Mức cf-DNA giữa các bệnh nhân là khác nhau, nhưng nếu xét trên từng bệnh nhân thì mức cf-DNA có tương quan rất lớn đến sự thay đổi của khối u trong quá trình điều trị. Lúc này chu kỳ bán rã ngắn của cf-DNA giúp kết quả xét nghiệm luôn phản ánh đúng thực trạng (real-time).

Mức cf-DNA sẽ giảm đáng kể sau 1-2 tuần nếu bệnh nhân đáp ứng điều trị. Hơn nữa, sự gia tăng mức cf-DNA thường quan sát được sớm hơn so với phim chụp X-quang ít nhất vài tuần. Do đó, công nghệ giám sát cf-DNA mang lại hiệu quả chi phí và tiềm năng lớn trong lâm sàng.

Theo dõi sự kháng thuốc của khối u không đồng nhất

Bản thân khối u thường tồn tại các dòng phụ (subclone) có tính kháng thuốc khác với tính kháng của toàn bộ khối u, đôi khi chỉ hiện diện trong một số vị trí di căn riêng biệt. Điều này khiến xét nghiệm sinh thiết khối u đôi khi không phát hiện ra sự kháng thuốc của các dòng phụ.

Dưới tác động của chọn lọc tự nhiên của liệu trình điều trị đưa ra, các dòng phụ dần sẽ chuyển thành dòng chính dẫn đến thay đổi tính kháng thuốc tổng thể của khối u sau một thời gian điều trị.

Phân tích cf-DNA định kỳ sẽ giúp phát hiện sớm những thay đổi tính kháng thuốc của khối u trong quá trình điều trị. Hơn nữa tính đại diện của cf-DNA giúp phát hiện cả tính kháng thuốc của các dòng phụ vì bản thân các dòng phụ vẫn sẽ phóng thích cf-DNA vào trong máu.

Phát hiện tồn dư của ung thư sau khi phẫu thuật

Một trong những ứng dụng to lớn nhất của xét nghiệm cf-DNA là phát hiện được bệnh ở những bệnh nhân chưa có biểu hiện lâm sàng, chẳng hạn như tầm soát ung thư.

Thông thường, phương pháp đầu tiên để chữa ung thư là phẫu thuật cắt bỏ khối u. Bất kỳ tế bào khối u nào còn xót lại sẽ dẫn đến tái phát, vì vậy một số trường hợp cần hóa trị bổ trợ để giảm nguy cơ tái phát. Để hạn chế số người cần hóa trị bổ trợ thì xét nghiệm cf-DNA là cực kỳ cần thiết, nhất là với những bệnh nhân ung thư ở giai đoạn 2.

Diehl và cộng sự đã nhận thấy phân tích cf-DNA chỉ một vài tuần sau khi phẫu thuật là đã có thể dự đoán chính xác những bệnh nhân ung thư đại trực tràng nào sẽ bị tái phát bệnh. Các nghiên cứu tương tự sau đó cũng đã chỉ ra phân tích cf-DNA có thể dự đoán được nguy cơ tái phát cho các bệnh ung thư khác như ung thư vú, ung thư phổi và ung thư tuyến tụy.

Xét nghiệm cf-DNA có khả năng sẽ trở thành một công cụ quan trọng trong tư vấn bệnh nhân ung thư cũng như để đưa ra các quy trình điều trị bổ trợ phù hợp đúng người, đúng bệnh.

Phát hiện sớm ung thư

Tiềm năng thần thánh nhất của sinh thiết lỏng đó là ứng dụng trong phát hiện ung thư giai đoạn sớm khi chưa có bất kỳ dấu hiệu lâm sàng nào, tất cả chỉ qua một xét nghiệm máu đơn giản.

Cho đến thời điểm hiện tại thì vẫn chưa có công nghệ nào đạt được mục tiêu đó. Để làm được điều này cần những phương pháp cực nhạy, tuy nhiên nhạy thì đi kèm dương tính giả, tầm soát một số lượng lớn bệnh nhân sẽ gây thiệt hại kinh tế không nhỏ vì vậy các nhà khoa học vẫn đang tiếp tục nghiên cứu.

Một vấn đề khác là nhiều loại ung thư có cùng dấu ấn (marker) nên việc khoanh vùng sau khi tầm soát cf-DNA cho kết quả dương tính cũng không dễ dàng, chưa kể việc một số tổn thương lành tính cũng có đột biến giống với ung thư (chẳng hạn như nốt ruồi hay bớt) và cf-DNA của chúng cũng gây nhiễu tín hiệu.

Dù còn nhiều vấn đề cần phải cải thiện, phân tích cf-DNA vẫn rất hữu ích trong phát hiện sớm ung thư.

Tóm tắt và định hướng trong tương lai

Phân tích cf-DNA là công nghệ mới nổi và đầy hứa hẹn trong ứng dụng lâm sàng đối với ung thư. Để phân tích cf-DNA trong lâm sàng một cách hiệu quả cần hiểu rõ ưu điểm và hạn chế của phương pháp để giải thích hợp lý các kết quả và đưa ra quyết định chính xác.

Mặc dù còn nhiều vấn đề cần phải nghiên cứu thêm trong tương lai, phân tích cf-DNA vẫn chứa đựng tiềm năng to lớn có thể làm thay đổi ngành y học ung thư.

Sơn Phạm – Lược dịch và tổng hợp

Tài liệu tham khảo

Corcoran, R. B., & Chabner, B. A. (2018). Application of cell-free DNA analysis to cancer treatment. New England Journal of Medicine, 379(18), 1754-1765.