Virus corona mới (2019-nCoV) gây viêm phổi nặng ở Vũ Hán, Trung Quốc từ tháng 12 năm 2019 đang có diễn biến rất phức tạp. Xét nghiệm chẩn đoán 2019-nCoV đang là vấn đề băn khoăn của nhiều người, đặc biệt là những ai làm việc trong lĩnh vực y tế và sinh học. Bài viết này sẽ cung cấp cho mọi người cái nhìn toàn cảnh về một quy trình để đưa ra được kết luận một người có bị nhiễm 2019-nCoV hay không.

Quy định về an toàn khi thao tác với Virus Corona mới (2019-nCoV)

– Nhân viên thu mẫu phải được đào tạo về an toàn sinh học cũng như được trang bị đầy đủ các thiết bị bảo hộ (găng tay, khẩu trang, …).

– Thao tác xử lý mẫu phải được thực hiện trong buồng an toàn sinh học cấp 2 (BSC2)

– Việc nuôi cấy hay phân lập virus (nếu có) thì phải được thực hiện trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3 (BSL3)

– Sau khi thao tác với mẫu xong phải khử trùng theo quy định của Cục bảo vệ môi trường (EPA) trong khử trùng bệnh viện.

– Tất cả rác thải phải được hấp tiệt trùng trước khi thải ra bên ngoài.

Thu nhận, bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm

Thu nhận mẫu

Thu mẫu là bước ảnh hưởng rất lớn đến kết quả xét nghiệm, thu loại mẫu gì, thu tại thời điểm nào, có cần kiêng cử gì trước khi thu mẫu hay không luôn là vấn đề trăn trở của các nhà khoa học. Hiện nay với 2019-nCoV thì vẫn chưa có nghiên cứu về việc thu mẫu vì vậy thường sẽ thu ít nhất 2 loại mẫu và thu ở nhiều thời điểm khác nhau, thực trạng cho thấy trong thời gian phát bệnh thì 2019-nCoV có hiện diện trong 3 loại mẫu:

– Mẫu dịch đường hô hấp dưới: thu nhận 2~3 mL dịch rửa phế quản, dịch hút khí quản hoặc đờm cho vào ống thu đờm vô trùng.

– Mẫu dịch đường hô hấptrên: thu nhận mẫu dịch phết mũi họng, hầu họng bằng tăm bông có thân bằng nylon, nhựa tổng hợp hoặc Dacron (không được sử dụng tăm bông có thân bằng gỗ hoặc calcium alginate) cho vào ống chứa dịch môi trường vận chuyển virus. Hoặc cũng có thể thu nhận 2~3 mL dịch rửa hút mũi họng cho vào ống thu đờm vô trùng.

–Mẫu huyết thanh: lượng máu tối thiểu cần cho xét nghiệm là 1 mL nên với trẻ sơ sinh vẫn cần phải lấy đủ lượng mẫu này, với các trường hợp khác nên lấy từ 5 – 10 mL máu tĩnh mạch cho vào trong ống bảo quản chống đông máu. Sau khi thu mẫu cần giữ ống máu thẳng đứng trong 30 phút và ly tâm với lực ly tâm tương đối từ 1,000 – 1,300 RCF trong 10 phút để thu nhận huyết thanh.

Bảo quản mẫu

– Tất cả các loại mẫu thu nhận cần được trữ mát (2-8 ^oC) trong suốt thời gian vận chuyển đến các phòng thí nghiệm của trung tâm xét nghiệm

– Trong trường hợp thời gian vận chuyển dự kiến lâu hơn 72h thì bắt buộc phải bảo quản ở -70 ^oC hoặc trong điều kiện lạnh hơn.

Vận chuyển mẫu

– Mẫu nên được vận chuyển bằng phong bì vận chuyển mẫu phù hợp với quy định của IATA dành cho các chất sinh học nhóm B.

Kỹ thuật xét nghiệm chẩn đoán Virus Corona mới (2019-nCoV)

Sơ lược về bộ kit xét nghiệm 2019-nCoV hiện tại

Ngày 17 tháng 01 năm 2020, WHO đã phối hợp với Viện virus học của Đại học Berlin Charite để công bố quy trình xét nghiệm 2019-nCoV bằng kỹ thuật realtime RT-PCR. Tiếp theo đó, CDC đã phát triển bộ kit dành cho quy trình xét nghiệm 2019-nCoV bằng realtime RT-PCR và đã được FDA đồng ý cấp Emergency Use Athorization (EUA) vào ngày 04 tháng 02 năm 2020.

(*) Emergency Use Athorization (EUA) là giấy công nhận cho phép sử dụng xét nghiệm (IVD) trong những trường hợp khẩn cấp. Thủ tục cấp giấy EUA sẽ khác với giấy CE-IVD.

Phương pháp realtime RT-PCR xét nghiệm 2019-nCoV trong mẫu bệnh phẩm dựa trên nguyên lý phát hiện sự hiện diện RNA của 2019-nCoV bằng cách đo tín hiệu huỳnh quang xuất hiện trong quá trình khuếch đại trình tự gene của 2019-nCoV bằng máy luân nhiệt (PCR).

Quy trình xét nghiệm 2019-nCoV có thể tóm gọn qua 4 bước: Tách chiết RNA từ mẫu → Phản ứng RT tạo cDNA → Phản ứng realtime PCR các trình tự mục tiêu → Đánh giá kết quả và kết luận.

Do 2019-nCoV có bộ gene là RNA và việc tách chiết RNA nghiêm ngặt rất nhiều so với tách chiết DNA, vì vậy trong quy trình xét nghiệm luôn bổ sung các mẫu chứng hỗ trợ kiểm soát chất lượng RNA đầu vào nhằm đảm bảo kết quả không bị sai lệch do quy trình tách chiết RNA gây ra (xem thêm ở Thiết kế phản ứng bên dưới). Ngoài ra, RNA tách chiết từ mẫu luôn phải bảo quản ở -70 ^oC hoặc trong điều kiện lạnh hơn.

Hạn chế của bộ kit realtime RT-PCR là kết quả không thể chắc chắn tình trạng nhiễm 2019-nCoV dù là âm tính hay dương tính mà cần phải phối hợp với các triệu chứng lâm sàng, tình hình dịch tễ cũng như xét nghiệm bổ sung như đem các mẫu dương tính đi giải trình tự Sanger, NGS hay nuôi cấy virus để có kết luận chính xác.

Thiết kế phản ứng xét nghiệm 2019-nCoV

Bộ kit realtime RT-PCR của CDC sử dụng 4 phản ứng khác nhau cho mỗi mẫu bệnh phẩm (Hình 1):

– 3 phản ứng dành cho phát hiện 3 vùng trình tự khác nhau (N1, N2, N3) trên bộ gene của 2019-nCoV

– 1 phản ứng dành cho gene chứng nội là RNase P (RP) của con người để kiểm soát chất lượng mẫu.

(*) Xem chi tiết trình tự mồi và mẫu dòTẠI ĐÂY

Ngoài ra với mỗi lần chạy xét nghiệm này CDC luôn khuyến cáo chạy kèm 1 bộ phản ứng (N1, N2, N3, RP) sử dụng nước cất (đã loại enzyme nuclease) thay cho cDNA để làm chứng âm (NTC) và 1 bộ phản ứng (N1, N2, N3, RP) sử dụng cDNA của 2019-nCoV (trong bộ kit có cung cấp) để làm chứng dương (nCoV PC) (Hình 2). Bên cạnh đó, trong suốt toàn bộ quy trình từ tách chiết đến RT và realtime PCR nên sử dụng 1 mẫu sinh phẩm từ người bình thường để làm đối chứng (HSC) nhằm đánh giá quy trình tách chiết RNA.

Chu trình nhiệt của phản ứng realtime RT-PCR (dùng chung cho cả 4 phản ứng N1, N2, N3, RP):

Bước RT tạo cDNA	Bước realtime PCR phát hiện cDNA của 2019-nCoV

Ý nghĩa các mẫu chứng trong xét nghiệm

Khi chạy xét nghiệm realtime RT-PCR để xét nghiệm 2019-nCoV, các mẫu chứng chạy kèm cần ra kết quả như kỳ vọng thể hiện trong Bảng 1:

– Mẫu chứng dương (nCoV PC) dùng để đánh giá hiệu quả của hóa chất phản ứng, chứng dương không đạt như kỳ vọng phản ánh hóa chất PCR đang gặp vấn đề.

– Mẫu chứng âm (NTC) dùng để đánh giá sự nhiễm mẫu của hóa chất, hóa chất không bị nhiễm mẫu sẽ luôn cho kết quả âm tính ở tất các phản ứng.

– Mẫu chứng tách chiết (HSC) dùng để đánh giá quá trình tách chiết, nếu quá trình tách chiết không gặp vấn đề thì phản ứng chứng nội (RP) luôn cho kết quả dương tính.

Đọc kết quả xét nghiệm và giải pháp xử lý

Sau khi xét nghiệm, mỗi mẫu bệnh phẩm kết quả sẽ luôn ra 1 trong các tình huống trình bày trong Bảng 2:

Xử lý các tình huống:

– Phát hiện 2019-nCoV: trả kết quả lại cho bên gửi mẫu và CDC, liên hệ CDC ngay lập tức để được hướng dẫn chuyển mẫu cho CDC làm các xét nghiệm bổ sung cũng như để được hướng dẫn thêm.

– Chưa có kết luận: Tách chiết và xét nghiệm lại, nếu kết quả vẫn như cũ thì phải liên hệ CDC ngay lập tức để được hướng dẫn chuyển mẫu cho CDC làm các xét nghiệm bổ sung cũng như để được hướng dẫn thêm.

– Không phát hiện 2019-nCoV: trả kết quả lại cho bên gửi mẫu, làm các xét nghiệm từ các loại mẫu khác để kết luận chính xác hơn.

– Không hợp lệ: Tách chiết và xét nghiệm lại, nếu kết quả vẫn như cũ thì cần yêu cầu thu lại mẫu khác.

Những hạn chế của phương pháp

– Xét nghiệm chẩn đoán realtime RT-PCR của CDCchỉ thực hiện trên mẫu dịch hô hấp trên và dịch hô hấp dưới như phần thu mẫu đã hướng dẫn.

– Kết quả âm tính không loại trừ khả năng nhiễm 2019-nCoV bởi vì mẫu bệnh phẩm tối ưu và thời điểm thu mẫu thích hợp vẫn chưa được xác định, vì vậy nên thu cùng một loại mẫu ở nhiều thời điểm khác nhau.

– Kết quả âm tính có thể xảy ra do quá trình thu nhận, vận chuyển, bảo quản mẫu không đúng cách hoặc do trong mẫu có chất ức chế phản ứng hay lượng virus không đủ cao.

– Âm tính giả và dương tính giả còn phụ thuộc vào tỷ lệ lưu hành bệnh. Nơi có tỷ lệ lưu hành bệnh cao thì hay bị âm tính giả và ngược lại nơi có tỷ lệ lưu hành bệnh thấp thì hay bị dương tính giả.

– Nếu virus có đột biến hoặc có chất ức chế, gây nhiễu sẽ làm âm tính giả. Nghiên cứu về ảnh hưởng của việc uống thuốc cảm lạnh đến kết quả xét nghiệm vẫn chưa được tiến hành.

Sơn Phạm – Lược dịch và tổng hợp

Tài liệu tham khảo

1) https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html

2) https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance

3) https://www.fda.gov/media/134920/download

4) https://www.fda.gov/media/134919/download