Trong bối cảnh dịch bệnh truyền nhiễm ngày càng trở nên phức tạp và khó kiểm soát, những vấn đề liên quan đến sự lây lan nhanh chóng của các mầm bệnh, sự xuất hiện của các chủng mới có khả năng lây nhiễm mạnh mẽ và sự đa kháng kháng sinh đang thu hút sự quan tâm đặc biệt. Bên cạnh đó, tình trạng đồng nhiễm – sự kết hợp của nhiều tác nhân gây bệnh trong cùng một cơ thể – đang trở thành yếu tố quan trọng trong chẩn đoán và điều trị các bệnh lý vi sinh, đặc biệt là trong các nhiễm trùng hô hấp. Những yếu tố này đang tạo ra những thách thức lớn đối với công tác điều trị và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Trong vi sinh lâm sàng truyền thống, việc xác định tác nhân gây bệnh thường yêu cầu quá trình nuôi cấy kéo dài (2-3 ngày đối với vi khuẩn, 7-21 ngày đối với nấm) hoặc sử dụng các kỹ thuật qPCR để phát hiện virus, nhưng các phương pháp này có độ phủ hẹp, chỉ xác định được một số chủng nhất định. Điều này có thể làm tăng thời gian chẩn đoán và đôi khi yêu cầu phải sử dụng các loại thuốc kháng sinh phổ rộng để kiểm soát tình trạng nhiễm trùng, dù chưa chắc chắn về nguyên nhân gây bệnh cụ thể.

Với sự phát triển của công nghệ giải trình tự gen, các phương pháp mới như Metagenomics, Whole Genome Sequencing (WGS) và Targeted Sequencing đã mở ra tiềm năng lớn trong việc cải thiện chẩn đoán và điều trị các bệnh truyền nhiễm. Những phương pháp này không chỉ giúp tăng cường độ nhạy trong việc phát hiện tác nhân gây bệnh mà còn có thể xác định chính xác các gen kháng kháng sinh, hỗ trợ các bác sĩ trong việc đưa ra các quyết định điều trị chính xác và kịp thời.

Metagenomics sẽ có điểm mạnh trong việc phát hiện đa tác nhân gây bệnh, giúp xác định không chỉ vi khuẩn mà còn virus, nấm và các vi sinh vật khác, đồng thời phát hiện các gen kháng kháng sinh liên quan với độ nhạy cao. Phương pháp này rất hữu ích trong việc xác định các tác nhân gây bệnh trong các tình huống nhiễm trùng phức tạp hoặc khi có nhiều tác nhân đồng nhiễm.

Whole Genome Sequencing (WGS) lại có thế mạnh trong việc phân tích và quản lý các chủng vi sinh vật, đồng thời hỗ trợ trong việc theo dõi tình trạng kháng kháng sinh và phân tích các cụm bùng dịch liên quan đến một loài vi khuẩn, nấm hoặc virus cụ thể. WGS cũng có thể giúp xác định genome của các loại bệnh truyền nhiễm mới xuất hiện hoặc mới nổi, mang lại cái nhìn sâu sắc hơn về các đặc điểm gen của các chủng mới, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho công tác phòng chống dịch bệnh.

Targeted Sequencing, sự kết hợp giữa các phương pháp multiplex PCR vốn được sử dụng rộng rãi và WGS, giúp tăng độ nhạy cho các loài virus có tỷ lệ thấp trong mẫu lâm sàng hoặc tập trung vào các vùng gen có ý nghĩa lâm sàng, như các gen liên quan đến kháng kháng sinh. Phương pháp này có thể sử dụng các đoạn probe hoặc primers để làm giàu các vùng gen mục tiêu, từ đó giúp phát hiện chính xác các tác nhân gây bệnh với chi phí hợp lý và thời gian xét nghiệm nhanh. Điều này đặc biệt hữu ích trong các trường hợp khi cần phát hiện những loài vi sinh vật hiếm gặp hoặc các gen kháng thuốc quan trọng.

Mặc dù các phương pháp giải trình tự gen này vẫn đang trong quá trình phát triển và chưa được ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn lâm sàng, chúng hứa hẹn sẽ hỗ trợ các bác sĩ và chuyên gia y tế trong việc đưa ra quyết định điều trị chính xác và hiệu quả hơn. Những tiến bộ này mang lại triển vọng lớn trong việc cải thiện công tác chẩn đoán và điều trị các bệnh nhiễm trùng, giúp nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ phát sinh tình trạng kháng thuốc trong cộng đồng.

Hình 1: Các giải pháp giải trình tự ứng dụng trong các bệnh truyền nhiễm (Nguồn: Novogene)

1. Giải Trình Tự Metagenomics và Ứng Dụng trong Nhiễm Trùng Hô Hấp Dưới

1.1. Giải Trình Tự Amplicon

Giải trình tự amplicon là một kỹ thuật dựa trên việc khuếch đại các vùng gen bảo tồn đặc trưng trong vi sinh vật, như 16S rRNA đối với vi khuẩn, ITS đối với nấm và 18S rRNA đối với động vật nguyên sinh. Sau khi khuếch đại, các vùng gen này sẽ được giải trình tự để xác định các loài vi sinh vật có trong mẫu bệnh phẩm.

Ứng dụng của phương pháp này chủ yếu tập trung vào việc xác định các loài vi khuẩn, nấm gây bệnh, đặc biệt là trong các bệnh truyền nhiễm. Giải trình tự amplicon có thể xác định chính xác các loài hoặc thậm chí đến chi vi sinh vật với chi phí thấp hơn rất nhiều so với shotgun metagenomics. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ có thể phát hiện được vi khuẩn và nấm, không bao gồm virus, và không phát hiện được các gen kháng kháng sinh (AMR genes) và không phát hiện được các loài vi sinh vật mới.

1.2. Giải Trình Tự Shotgun Metagenomics

Khác với giải trình tự amplicon, phương pháp Shotgun metagenomics cho phép phân tích toàn bộ DNA của các vi sinh vật có trong mẫu bệnh phẩm mà không cần nhắm đến các vùng bảo tồn đặc trưng của từng loài để khuếch đại hoặc phải phân lập, nuôi cấy trước đó. Về nguyên lí, Shotgun metagenomics giúp mô tả chức năng của các đoạn đọc, lắp ráp gen mới và trong trường hợp tốt nhất, tái dựng toàn bộ hệ gen được lắp ráp trong metagenome. Đây là phương pháp đặc biệt hữu ích trong việc nghiên cứu đa dạng các tác nhân gây bệnh, bao gồm cả virus.

Thông qua Shotgun metagenomics, các nhà nghiên cứu có thể phát hiện không chỉ vi khuẩn mà còn cả virus, nấm và các vi sinh vật khác. Phương pháp này còn có khả năng phát hiện các gen kháng kháng sinh, cung cấp cái nhìn toàn diện về tình trạng kháng thuốc của các tác nhân gây bệnh. Một ưu điểm lớn của phương pháp này là khả năng phát hiện các chủng mới hoặc các loài vi sinh vật chưa được mô tả trước đây. Tuy nhiên, shotgun metagenomics thường phân tích tất cả DNA có trong mẫu, bao gồm cả DNA vật chủ và các loài vi sinh vật. Vì vậy, đối với các tác nhân gây bệnh là virus thường sẽ gặp những khó khăn nhất định do virus chiếm tỉ lệ thấp trong mẫu, có thể phải tăng độ sâu giải trình tự để có đủ thông tin virus. Điều này dẫn đến yêu cầu chi phí cao và phân tích tin sinh phức tạp.

2. Giải Trình Tự Toàn Bộ Hệ Gen (WGS) và Ứng Dụng trong Vấn Đề Kháng Lao

Giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) là phương pháp cho phép phân tích toàn bộ hệ gen của một loài vi khuẩn hoặc nấm sau khi đã phân lập và nuôi cấy. WGS cung cấp thông tin chi tiết và toàn diện về hệ gen của một tác nhân gây bệnh nhất định, bao gồm các thông tin về đột biến gen, gen độc lực, và gen kháng kháng sinh. WGS hiện được xem là phương pháp tham chiếu trong các nghiên cứu dịch tễ genome và truy vết nguồn lây của tác nhân vi sinh, được dùng rộng rãi trong giám sát dịch bệnh và điều tra ổ dịch.

Trong nghiên cứu và chẩn đoán lao, WGS là kĩ thuật vô cùng quan trọng (hình 2). Phương pháp này cho phép xác định chính xác các đột biến trong gen của Mycobacterium tuberculosis, vi khuẩn gây bệnh lao, đặc biệt là các đột biến liên quan đến kháng thuốc. WGS có thể giúp phân tích chủng vi khuẩn (strain typing), giúp xác định loại vi khuẩn, dòng vi khuẩn và sự lan truyền của chúng trong cộng đồng hoặc bệnh viện. Bên cạnh đó, phương pháp này còn hỗ trợ trong việc giám sát sự xuất hiện của các chủng kháng thuốc, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho việc điều trị hiệu quả và kịp thời.

Hình 2: Quy trình thường gặp trong giải trình tự toàn bộ hệ gen của các chủng Mycrobacterium tuberculosis (Meehan CJ, et.al, 2019).

Mẫu bệnh phẩm lâm sàng (thường là đờm) trước tiên được nuôi cấy trong tối đa 6 tuần. Sau đó, DNA hệ gen được tách chiết và đem đi giải trình tự. Dữ liệu giải trình tự thu được (file fastq) có thể được đưa lên các kho dữ liệu công khai và/hoặc chạy qua các pipeline phân tích SNP chuẩn.

Các pipeline này sẽ lắp ráp dữ liệu đoạn đọc vào bộ gen tham chiếu (thường là chủng M. tuberculosis H37Rv), sau đó gọi biến dị di truyền (variant calling), tạo ra một bảng SNP. Danh sách SNP thu được có thể được dùng cho nhiều mục đích phân tích: định type chủng, phân tích cụm lây truyền, và dự đoán hồ sơ kháng thuốc. Ví dụ bệnh nhân trong hình kháng với Rifampicin nhưng nhạy với Isoniazid, gợi ý thông tin kháng sinh phù hợp điều trị cho bệnh nhân.

3. Giải Trình Tự Các Vùng Mục Tiêu và Ứng Dụng trong Xét Nghiệm Phát Hiện Lao

Giải trình tự các vùng mục tiêu là phương pháp giải trình tự các đoạn gen cụ thể được xác định trước, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí. Trước khi giải trình tự,  thư viện hoặc các đoạn DNA mục tiêu sẽ được làm giàu thông qua việc sử dụng các probe hoặc primers đặc biệt, nhằm tăng cường tín hiệu từ các vùng gen liên quan đến các tác nhân gây bệnh.

Phương pháp này thường được ứng dụng trong việc phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là tuberculosis (lao), thông qua việc giải trình tự các vùng gen đặc trưng như 16S rRNA đối với vi khuẩn. Ưu điểm của giải trình tự các vùng mục tiêu là có thể sử dụng để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh với thời gian trả kết quả nhanh và chi phí thấp. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ hiệu quả khi các đoạn gen mục tiêu đã được xác định rõ ràng từ trước và không thể cung cấp thông tin toàn diện về sự đa dạng của các vi sinh vật có trong mẫu.

Giải trình tự các vùng mục tiêu trong metagenomics là phương pháp tập trung vào các đoạn gen hoặc bộ gen đã được xác định trước, thay vì giải trình tự toàn bộ hệ gen trong mẫu. Cách tiếp cận này cho phép tối ưu chi phí, rút ngắn thời gian phân tích và đặc biệt làm tăng độ nhạy trong việc phát hiện các tác nhân gây bệnh. Nguyên lý cơ bản của phương pháp là lựa chọn những vùng gen liên quan trực tiếp đến mầm bệnh hoặc gen kháng kháng sinh, sau đó tiến hành bước làm giàu bằng probe hay primer đặc hiệu để tăng tỷ lệ đọc trúng đích trong quá trình giải trình tự. Nhờ đó, tỷ lệ phát hiện có thể được cải thiện từ mức cực thấp, dưới 0,1%, lên đến hàng chục phần trăm hoặc hơn.

Giải trình tự vùng mục tiêu được sử dụng nhiều trong những tình huống mà yêu cầu chẩn đoán nhanh, chính xác và định hướng điều trị sớm là đặc biệt quan trọng. Phương pháp này hiệu quả khi xử lý các bệnh truyền nhiễm do virus hoặc vi khuẩn có nguy cơ đồng nhiễm cao. Ngoài ra, nó còn có vai trò quan trọng trong bối cảnh các bệnh lý mà tình trạng kháng thuốc nghiêm trọng, giúp nhận diện trực tiếp những gen hoặc đột biến kháng kháng sinh có ý nghĩa lâm sàng thay vì điều trị dựa trên kinh nghiệm hoặc lạm dụng kháng sinh phổ rộng trong điều trị.

Hiện nay, phương pháp này thường được triển khai dưới dạng các bộ panel thương mại đã thiết kế sẵn, phục vụ cho chẩn đoán nhanh, giám sát dịch bệnh hoặc nghiên cứu dịch tễ. Một ví dụ ứng dụng là bộ kit thương mại phát hiện lao abNEX^TMMTB/MDR Kit, có khả năng nhận diện Mycobacterium tuberculosis complex bao gồm Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG, Mycobacterium tuberculosis bovis, Mycobacterium tuberculosis africanum và 99 loài Mycobacteria không lao, đồng thời phát hiện 34 gen kháng thuốc liên quan đến 17 thuốc chống lao và 3 thuốc chống NTM. Bộ kit này còn định danh được 48 tác nhân gây đồng nhiễm, trong đó có 1 số vi khuẩn gây viêm phổi thường gặp như Streptococcus pneumoniae (phế cầu), Klebsiella pneumoniae, K. aerogenes với độ nhạy cao (tới 50 copies/mL) và phạm vi áp dụng rộng trên nhiều loại bệnh phẩm hô hấp.

Hình 3: Panel gene cung cấp bởi abNEX^TMMTB/MDR Kit

Ưu điểm nổi bật của giải trình tự các vùng mục tiêu là tốc độ, chi phí hợp lý và độ nhạy cao đối với những mầm bệnh đã biết nên rất hữu ích trong bối cảnh chẩn đoán lâm sàng cũng như giám sát dịch tễ. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn có giới hạn là phụ thuộc vào thiết kế panel, chỉ phát hiện được các tác nhân đã được biết trước, do đó không cung cấp được cái nhìn toàn diện về sự đa dạng vi sinh vật trong mẫu như metagenomics toàn bộ.

4. Tóm Tắt

Tóm lại, cả ba phương pháp Metagenomics, Whole genome sequencing (WGS) và Targeted sequencing đều có những ứng dụng quan trọng trong nghiên cứu và chẩn đoán các bệnh lý vi sinh. Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và hạn chế riêng biệt:

• Metagenomics giúp phát hiện đa dạng các tác nhân gây bệnh nhưng có thể có chi phí cao (shotgun metagenomics) và cần kỹ thuật phức tạp.
• WGS là phương pháp theo dõi chủng nấm/vi khuẩn với độ phân giải cao, có thể xác định đột biến gen và kiểm soát tình trạng bùng dịch, kháng kháng sinh.
• Targeted sequencing cung cấp kết quả nhanh chóng và chi phí thấp, phù hợp cho việc xét nghiệm nhanh các vi sinh vật gây bệnh cụ thể, đặc biệt trong các trường hợp lao.

Mỗi phương pháp có thể được sử dụng tùy theo nhu cầu cụ thể của từng trường hợp nghiên cứu hoặc xét nghiệm lâm sàng, và trong nhiều trường hợp, chúng có thể được kết hợp với nhau để đạt hiệu quả tối ưu trong các ứng dụng lâm sàng.

5. Nguồn tham khảo

AIT Biotech. abNEXT MTB/MDR Kit – Brochure.

Meehan, C.J., Goig, G.A., Kohl, T.A. et al. Whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis: current standards and open issues. Nat Rev Microbiol 17, 533–545 (2019). https://doi.org/10.1038/s41579-019-0214-5.