Đo nồng độ nucleic acid tại bước sóng 260 nm

Dữ liệu hiệu năng thiết bị NanoDrop One

Tác giả: Sean Loughrey, Jessica Mannion, và Brian Matlock, Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE

Tóm tắt

Các nhà khoa học có thể đánh giá chất lượng các mẫu nucleic acid bằng thiết bịNanoDrop™ One/OneC khi sử dụng các chương trình được lập trình sẵn chocác chỉ tiêu dsDNA, ssDNA, RNA, oligo DNA và oligo RNA (hình 1). Tài liệu kỹ thuật này sẽ cung cấp các dữ liệu về hiệu năng của thiết bị NanoDrop khi đomẫu dsDNA.

Với thiết bị NanoDrop One, bạn không cần phải biết trước về nồng độ mẫu để đảm bảo độ chính xác của phép đo, vì nồng độ mẫu hầu như luôn nằm trong phạm vi đo của thiết bị. Thiết bị NanoDrop One đã được đánh giá về độ chính xác trên phạm vi đo này bằng cách so sánh kết quả đo các mẫu nucleic acid bằng thiết bị quang phổ UV-Vis Thermo Scientific™ Evolution™ 300, sử dụng cuvet. Dữ liệu cho thấy thiết bị NanoDrop One/OneC có thể đo chính xác các mẫu dsDNA với nồng độ thấp nhất là 3 ng/µL và nồng độ cao nhất là 28,000 ng/µL (cũng như 18,150 ng/µL cho ssDNA và 22,000 ng/µL cho RNA).

Giới thiệu

Máy quang phổ NanoDrop One có khả năng đo chính xác các mẫu với nồng độ từ 2 đến 27,500 ng/μL dsDNA (0.04–550A) chỉ với 1 đến 2 μL mẫu. Hệ thống chứa mẫu đã được cấp bằng sáng chế* và công nghệ tự động điều chỉnh độ dài đường quang của thiết bị NanoDrop One/OneC cho phép người dùng đo các mẫu có phạm vi nồng độ rộng, loại bỏ các bước pha loãng và tiết kiệm vật tư tiêu hao.

GHI CHÚ: thiết bị NanoDrop OneC bao gồm 2 phương pháp đo mẫu là bệ đo và cuvet. Dữ liệu được trình bày ở đây được thu thập từ thiết bị NanoDrop One và phản ánh độ chính xác của các phương pháp đo trên bệ đo của cả hai thiết bị NanoDrop One và NanoDrop OneC.

Phương pháp

Các mẫu dsDNA với nồng độ dao động từ 3 đến 28,000 ng/µL, được chuẩn bị bằng cách pha loãng dsDNA sodium salt từ tinh hoàn cá hồi (Sigma Aldrich®, #D1626) trong nước HPLC (Acros Organics™, #268300040). Nồng độ ban đầu của dung dịch dsDNA được xác định bằng phương pháp đo quang phổ tại bước sóng 260 nm sử dụng máy Evolution 300 như là thiết bị tham chiếu. Các mẫu nằm ngoài giới hạn phát hiện của thiết bị tham chiếu đã được pha loãng để nằm trong phạm vi đo của máy. Các giá trị nồng độ thu được từ các mẫu pha loãng trên thiết bị Evolution 300 đã được sử dụng để tính toán nồng độ ban đầu của các mẫu dsDNA; các hệ số thích hợp được áp dụng để tính toán hệ số pha loãng và sự khác biệt về chiều dài quang phổ khi cần. Sau đó, độ hấp thụ của từng dung dịch được đo trên thiết bị NanoDrop One sử dụng chương trình ứng dụng dsDNA. Thể tích mẫu dùng để đo nồng độ cho từng thiết bị là: 1) 1 µL cho thiết bị NanoDrop One, 2) 3 mL trong cuvet thạch anh 10 mm cho thiết bị Evolution 300, và 3) 1 µL trong Hellma® Analytics TrayCell cho thiết bị Evolution 300.

Để tính toán nồng độ của từng mẫu, phần mềm NanoDrop One sử dụng độ hấp thụ đo được tại bước sóng 260 nm, hệ số tương quan cho dsDNA (50 ng/µL cm⁻¹) và định luật Beer. Giá trị nồng độ trung bình thu được từ cả hai thiết bị NanoDrop One và Evolution 300 (Bảng 1) đã được lập biểu đồ (Hình 2 và 3) và phân tích. Kết quả này chứng minh mức độ tương đồng cao trong kết quả đo giữa hai thiết bị quang phổ.

Các thông số về độ tái lập khi đo nucleic acid đã được công bố trên máy quang phổ NanoDrop One cho thấy độ lệch chuẩn là ±2 ng/µL đối với nồng độ mẫu trong khoảng từ 2.0 đến 100 ng/µL, và ±2% CV đối với các mẫu có nồng độ >100 ng/µL đo trên bệ. Bảng 2 trình bày dữ liệu độ tái lập từ 10 lần lặp lại của các mẫu dsDNA có nồng độ từ 3 đến 28,000 ng/µL. Dữ liệu độ lệch chuẩn cho thấy độ lặp lại vượt trội của máy quang phổ NanoDrop One. Độ tái lập tốt khi khảo sát trong toàn bộ khoảng nồng độ mẫu (Bảng 2).

Kết luận

Thiết bị quang phổ NanoDrop One cho thấy tính tuyến tính tốt trên toàn bộ dải đo của thiết bị (Hình 2) và cả trong dải nồng độ thấp (Hình 3). Các giá trị R² được tính toán trong cả hai trường hợp cho thấy sự tương quan cao giữa các nồng độ thu được từ phương pháp đo cuvet trên thiết bị tham chiều và NanoDrop One. NanoDrop One có thể đạt được mức độ tin cậy cao này nhờ vào công nghệ *giữ mẫu trên bệ đo đã được cấp bằng sáng chế và tính năng tùy chọn chiều dài quang đường tự động, điều này rất quan trọng trong việc thực hiện việc đo mẫu với thể tích nhỏ chỉ từ 1-2 µL.

Ngoài độ chính xác cao trong toàn bộ dải nồng độ được thử nghiệm, NanoDrop One còn giúp tiết kiệm thời gian và chi phí với cách vận hành đơn giản, yêu cầu thể tích mẫu chỉ từ 1–2 µL. Thiết bị này loại bỏ bước pha loãng mẫu và giúp tiết kiệm các vật tư tiêu hao tốn kém như cuvet thạch anh. Với nhiều chương trình đo được cài đặt sẵn, phù hợp đặc biệt với các phòng thí nghiệm khoa học sự sống, cùng với màn hình cảm ứng độ phân giải cao và phần mềm trực quan dễ sử dụng, NanoDrop One mang đến trải nghiệm nhanh chóng và thuận tiện, đồng thời vẫn đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy cho người dùng.