Nhận diện tạp nhiễm RNA trong mẫu DNA động vật có vú

Sử dụng thuật toán UV-Vis tiên tiến để tăng độ đặc hiệu

Giới thiệu

Phương pháp định lượng nucleic acid truyền thống dựa trên việc xác định độ hấp thụ ở ba bước sóng phân tích: 230 nm, 260 nm và 280 nm. Thông tin thu nhận từ độ hấp thụ này cho phép các nhà khoa học tính toán nồng độ nucleic acid và đánh giá độ tinh sạch của mẫu. Tuy nhiên, một hạn chế của phương pháp này là thiếu độ đặc hiệu, do đó, bất kỳ tạp chất nào hấp thụ tại các bước sóng này đều có thể dẫn đến sự sai lệch về nồng độ nucleic acid trong mẫu.

Thiết bị quang phổ Thermo Scientific™ NanoDrop™ One/OneC, với phần mềm tích hợp Thermo Scientific™ Acclaro™ Intelligence Technology, sử dụng dữ liệu quang phổ và các thuật toán tiên tiến để nhận diện tạp chất trong mẫu nucleic acid và tính toán nồng độ nucleic acid đã hiệu chỉnh. Trong tài liệu này, chúng tôi sẽ trình bày cách tính năng mới trong phần mềm Acclaro giúp người dùng nhận dạng và hiệu chỉnh tạp nhiễm RNA trong mẫu DNA hoặc tạp nhiễm DNA trong mẫu RNA.

Vật liệu và phương pháp

DNA và RNA được ly trích từ tế bào HeLa, sau đó được xử lý với RNase hoặc DNase để loại bỏ các tạp nhiễm nucleic acid khác và hòa tan trong dung dịch TE, pH 8.0. Nồng độ ban đầu của các mẫu được xác định bằng thiết bị NanoDrop One với dung dịch trắng là TE. Các hỗn hợp DNA và RNA đa dạng được chuẩn bị (trong hình 1), mỗi mẫu được đo ba lần. Một aliquot mới 2,0 μL của hỗn hợp tương ứng được sử dụng cho mỗi lần đo lặp lại. Các kết quả nồng độ DNA sau đó được tính toán:

• Nồng độ DNA theo lý thuyết: Độ hấp thụ bước sóng A260 sau hiệu chỉnh nền A260 *50 ng/μL*(%DNA/100).
• Nồng độ DNA chưa hiệu chỉnh: Độ hấp thụ bước sóng A260 sau hiệu chỉnh nền A260 *50 ng/μL.
• Nồng độ DNA đã qua Acclaro: Độ hấp thụ bước sóng A260 sau hiệu chỉnh bằng Acclaro *50 ng/μL

Nồng độ DNA lý thuyết, chưa hiệu chuẩn và sau hiệu chuẩn với công nghệ Acclaro được so sánh với nhau, sử dụng bộ kit chuyên dụng để định lượng DNA bằng phương pháp huỳnh quang. Một đường chuẩn được dựng theo đúng quy trình của bộ kit. Các mẫu chuẩn được chuẩn bị bằng cách thêm 10 μL DNA chuẩn vào 200 μL dung dịch phản ứng. Các mẫu nucleic acid được chuẩn bị bằng cách thêm 2,0 μL mẫu vào 200 μL dung dịch phản ứng, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút và đo bằng thiết bị đọc huỳnh quang. Các số liệu nồng độ DNA trung bình và độ lệch chuẩn từng mẫu được trình bày trong hình 1.

Kết quả

Khi tính toán nồng độ DNA trong các mẫu có tạp nhiễm RNA, kết quả sẽ bị sai lệch nếu chỉ dựa vào độ hấp thụ ở bước sóng A260. Cả DNA và RNA đều hấp thụ ánh sáng ở bước sóng A260, nên việc chỉ sử dụng độ hấp thụ này để tính nồng độ DNA có thể dẫn đến ước tính cao hơn lượng DNA thực tế trong các mẫu có lẫn RNA.

Kết quả sau khi được hiệu chỉnh bằng Acclaro (các cột màu xanh lục) cho thấy độ chính xác rất cao trong việc đo các mẫu DNA có tạp nhiễm RNA. Thuật toán Acclaro sử dụng toàn bộ dữ liệu biểu đồ quang phổ, kết hợp với phân tích thống kê toán học, để xác định chính xác lượng DNA thực tế trong hỗn hợp DNA/RNA. Nồng độ DNA sau khi hiệu chỉnh bằng Acclaro gần như tương đồng với nồng độ DNA được đo bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang đặc hiệu với DNA.

Kết luận

Tạp nhiễm RNA trong các mẫu DNA là một vấn đề phổ biến trong các quy trình thí nghiệm và xét nghiệm sinh học phân tử. Khi sử dụng phương pháp quang phổ truyền thống để xác định nồng độ, RNA trong mẫu có thể làm tăng giả tạo nồng độ DNA thực tế. Mặc dù sử dụng hóa chất nhuộm huỳnh quang đặc hiệu với DNA có thể cung cấp kết quả nồng độ DNA chính xác hơn so với phương pháp đo độ hấp thụ A260, nhưng sự hiện diện của tạp nhiễm RNA trong DNA vẫn có thể ảnh hưởng tiêu cực đến quy trình thí nghiệm.

Chúng tôi đã chứng minh rằng, bằng cách sử dụng toàn bộ dữ liệu biểu đồ quang phổ kết hợp với phân tích thống kê toán học, các nhà nghiên cứu có thể khắc phục những hạn chế của cả hai phương pháp đã đề cập. Phần mềm Acclaro trên máy quang phổ NanoDrop One cho phép nhận dạng tạp nhiễm RNA trong mẫu DNA và cung cấp kết quả nồng độ đã hiệu chỉnh. Hai yếu tố này giúp các nhà nghiên cứu nhanh chóng xử lý các vấn đề trong quá trình tách chiết và cải thiện độ chính xác của các quy trình tiếp theo.