Đánh giá Axit nucleic trước qPCR và RT-qPCR dựa trên hướng dẫn MIQE

Máy quang phổ NanoDrop

Hướng dẫn MIQE

PCR định lượng (qPCR) là một kỹ thuật định lượng cơ bản được sử dụng trong chẩn đoán phân tử và lâm sàng. Trước năm 2009, việc chuẩn hóa báo cáo chưa đầy đủ và do đó, các kết quả của thí nghiệm thường khó lặp lại. Ngoài ra, nhiều giả định về kỹ thuật qPCR thường không được chứng minh, bao gồm cả những giả định liên quan đến hiệu quả khuếch đại và tính ổn định của gen tham chiếu. Để cải thiện thiết kế thí nghiệm, xác nhận và báo cáo liên quan, hướng dẫn thông tin tối thiểu cần cung cấp trong các bài báo liên quan đến PCR định lượng thời gian thực (MIQE) đã được đề xuất.

Cơ sở cho các hướng dẫn MIQE là việc công bố đầy đủ các phương pháp cho phép đánh giá tính hợp lệ của quy trình làm việc, kết quả thí nghiệm và tính nhất quán giữa quy trình làm việc trong các phòng thí nghiệm. Trong đó, các tiêu chí sau đây đóng vai trò quan trọng và cần phải được cung cấp trong các báo cáo nghiên cứu liên quan đến PCR: định lượng axit nucleic, đánh giá mức độ tạp nhiễm(DNA hoặc RNA) và định lượng RNA/cDNA/DNA được thêm vào phản ứng. Độ tinh khiết của axit nucleic, thường được tính toán dựa trên tỷ lệ hấp thụ A260/A280 cũng là một thông số cần thiết trong quá trình đánh giá.

Kiểm soát chất lượng với máy quang phổ NanoDrop

Máy quang phổ UV-Vis Thermo Scientific™ NanoDrop™ Microvolume sử dụng công nghệ giữ mẫu tiên tiến, giữ lại 1.0 – 2.0 µL mẫu giữa hai sợi cáp quang nhờ lực căng bề mặt. Khả năng đo vi thể này giúp bảo toàn các mẫu quý giá và hạn chế cho các kỹ thuật sinh học phân tử được thực hiện trong những bước tiếp theo. Như được mô tả trong Hình 1, các thiết bị NanoDrop sử dụng các đường quang có độ dài khác nhau thay đổi theo thời gian thực trong quá trình đo mẫu, giúp mở rộng phạm vi động học của phép đo.
Ngược lại với các thiết bị NanoDrop, việc đo mẫu bằng cuvet 10 mm tiêu chuẩn trên máy quang phổ thông thường có giới hạn phát hiện trên là 50 ng/µL với thể tích mẫu tối thiểu là 1.0 mL. Giới hạn phát hiện này đòi hỏi kĩ thuật pha loãng cũng như yêu cầu thể tích mẫu lớn, khiến cho quy trình làm việc dễ xảy ra sai sót và hạn chế thể tích mẫu có thể sử dụng cho các thí nghiệm sau đó. Việc sử dụng cuvet cũng có khả năng dẫn đến nhiễm chéo từ các mẫu trước đó nếu không được vệ sinh đúng cách.

Máy quang phổ NanoDrop cũng có chu kỳ đo nhanh. Tổng thời gian chu kỳ của các thiết bị NanoDrop dao động từ 5 giây đến 20 giây, tùy thuộc vào kiểu máy. Thiết bị NanoDrop Eight, cho phép đo đồng thời 8 mẫu microvolume để có thông lượng cao hơn, có tổng thời gian chu kỳ là 20 giây hoặc ít hơn. Phần mềm NanoDrop trực quan hiển thị nồng độ DNA đã tính toán, tỷ lệ độ tinh khiết của axit nucleic và quang phổ của từng mẫu. (Quang phổ mẫu không khả dụng cho NanoDrop Lite Plus).

Tại sao việc định lượng lại quan trọng?

Đối với định lượng tuyệt đối sử dụng đường chuẩn, các mẫu phải nằm trong phạm vi của đường chuẩn. Khi được vẽ đồ thị như trong Hình 2, đường chuẩn có dạng tuyến tính, tuy nhiên chúng không duy trì dạng này mãi mãi. Khi nồng độ mẫu vượt qua một mức giới hạn có thể ảnh hưởng đến phản ứng PCR, hiệu suất khuếch đại sẽ giảm. Ở nồng độ mẫu thấp, tín hiệu nền có thể bị nhầm lẫn với tín hiệu khuếch đại, làm tăng độ biến thiên của dữ liệu. Ở nồng độ mẫu cao, phản ứng PCR có thể bị ức chế.

Việc ngoại suy đường chuẩn để mở rộng phạm vi lớn hơn có nhiều rủi ro; do đó, nên đảm bảo rằng các mẫu chưa biết nằm trong một khoảng nồng độ phù hợp trước khi thực hiện PCR.

Đối với định lượng tương đối, chẳng hạn như định lượng biểu hiện gen bằng RT-qPCR, số lượng khuôn mẫu thấp làm tăng sai sót có thể xảy ra.3 Ngay cả các phương pháp tạo ra dữ liệu định tính như phân tích tính đa hình thái đơn nucleotid (SNP) cũng đáng tin cậy hơn khi thực hiện bằng cách sử dụng số lượng mẫu thích hợp. Hình 3 minh họa rằng cường độ tín hiệu đối với các mẫu chưa biết phải tương tự như các mẫu chuẩn khi thực hiện phân tích kiểu gen SNP. Số lượng khuôn mẫu thấp làm cho việc xác định các alen không đáng tin cậy hoặc không thể thực hiện được. Sự đồng đều khi load các khuôn mẫu khác nhau đóng vai trò quan trọng không thể thiếu của thiết kế thử nghiệm trong các nghiên cứu biểu hiện gen, đặc biệt khi so sánh giữa các mẫu không xử lý và được xử lý.

Một trường hợp phổ biến hơn chứng minh tầm quan trọng trong việc định lượng chính xác: khi xác nhận các gen tham chiếu mới. Việc xác nhận gen tham chiếu cho RT-qPCR có thể được thực hiện bằng cách đầu tiên là tách chiết RNA từ các mẫu chứng và mẫu thử nghiệm. Sau khi phiên mã ngược, lượng cDNA được chuẩn hóa để đảm bảo tải lượng bằng nhau được nạp vào phản ứng qPCR. Sau đó, PCR định lượng được thực hiện bằng cách sử dụng các đoạn mồi (và đầu dò, nếu cần) cho gen ứng viên và xác định số chu kỳ Cq cho từng mẫu. Phân tích thống kê số chu kỳ Cq sau đó được thực hiện để kiểm tra sự khác biệt giữa mẫu chứng và mẫu thử nghiệm. Do đó, gen tham chiếu ứng viên phù hợp cho các nghiên cứu về biểu hiện gen trong tương lai bằng cách sử dụng tổ hợp mẫu chứng và thử nghiệm đã được kiểm tra.

Tại sao sự tinh khiết lại quan trọng?

Các hóa chất bị tạp nhiễm còn sót lại từ các quy trình tách chiết có thể ảnh hưởng đáng kể đến quy trình phân tích sau đó; tuy nhiên, nhiều chất gây tạp nhiễm có thể phát hiện được bằng máy quang phổ NanoDrop.3,4 Hình 4 cho thấy một mẫu DNA tinh khiết, cùng với mẫu bị tạp nhiễm protein và phenol. Khi kiểm tra ban đầu, cả hai mẫu bị tạp nhiễm dường như đều tạo ra quang phổ tương tự như axit nucleic “tinh khiết” và trên thực tế, tỷ lệ A260/A280 được thấy đối với mẫu tạp nhiễm phenol thường ở trạng thái bình thường.

Công nghệ Thermo Scientific™ Acclaro™ Sample Intelligence được tích hợp trong phần mềm NanoDrop One/OneC và NanoDrop Eight giúp giải quyết những lo ngại này. Bằng cách sử dụng phương pháp tiếp cận hóa học, tính năng Acclaro Contaminant Identification phân tích các thành phần hóa học có trong mẫu và xác định các chất gây tạp nhiễm mẫu phổ biến (Hình 5). Tính năng này loại bỏ sự phỏng đoán thường thấy để phân tích và xử lý sự cố tỷ lệ tinh khiết và quang phổ.

Đối với các máy quang phổ UV-Vis khác không sử dụng công nghệ Acclaro, chẳng hạn như thiết bị NanoDrop Lite Plus, tỷ lệ tinh khiết có thể hỗ trợ xác định chất gây tạp nhiễm. Nhiều chất gây tạp nhiễm dẫn đến thất bại trong các ứng dụng về sau có thể hấp thụ ở khoảng 230 nm hoặc thấp hơn. Ngoài việc kiểm tra tỷ lệ A260/A280 và hình dạng chung của quang phổ, chúng tôi khuyến nghị như sau:

• Kiểm tra tỷ lệ A260/A230 – tỷ lệ thấp có thể là do các chất tạp nhiễm ở bước sóng 230 nm hoặc thấp hơn.
• Kiểm tra bước sóng của máng trong quang phổ –bước sóng này phải là 230nm. Sự hấp thụ của chất gây tạp nhiễm ở bước sóng thấp thường sẽ làm tăng bước sóng của máng.
• Kiểm tra bước sóng của đỉnh trong quang phổ –bước sóng này phải là 260nm đối với DNA và RNA.

Sự hấp thụ ở bước sóng cao hơn của chất tạp nhiễm sẽ làm tăng bước sóng của đỉnh. Một số chất gây tạp nhiễm có đặc điểm riêng, chẳng hạn như phenol, tuy nhiên nhiều chất gây tạp nhiễm có chung các đặc điểm như hấp thụ ở 230 nm hoặc thấp hơn. Hấp thụ ở 230 nm có thể chỉ ra nhu cầu tối ưu hóa lại quy trình tách chiết. Độ hấp thụ cao tại 230 nm hoặc tỷ lệ A260/A230 kém có thể là do những nguyên nhân sau:
• Carbohydrate (thường gặp trong quá trình tách chiết thực vật)
• Phenol còn sót lại từ quá trình tách chiết axit nucleic
• Guanidine còn sót lại từ quá trình tách chiết cột
• Glycogen được sử dụng để kết tủa

Phần kết luận

Theo hướng dẫn MIQE, việc đo lường axit nucleic là bắt buộc, trong khi việc đánh giá độ tinh khiết thì nên thực hiện bổ sung nếu có thể. Sử dụng kết hợp cả việc đo lượng và độ tinh khiết không chỉ có lợi cho việc thiết kế các thí nghiệm mà còn cải thiện chất lượng báo cáo. Sử dụng máy quang phổ NanoDrop để kiểm tra axit nucleic có thể giúp tiết kiệm đáng kể thời gian và chi phí bằng cách ngăn ngừa việc thực hiện lại các thí nghiệm phức tạp phía sau. Các bước làm sạch sau khi tách chiết chỉ mất thêm một khoảng thời gian ngắn, giúp quản lí rủi ro hiệu quả hơn so với việc lặp lại toàn bộ một thí nghiệm như qPCR.

Tài liệu tham khảo

1. Stephen A. Bustin, Vladimir Benes, Jeremy A. Garson, Jan Hellemans, Jim Huggett, Mikael Kubista, Reinhold Mueller, Tania Nolan, Michael W. Pfaffl, Gregory L. Shipley, Jo Vandesompele, Carl T. Wittwer, Hướng dẫn MIQE: Thông tin tối thiểu để công bố thí nghiệm PCR định lượng thời gian thực, Clinical Chemistry, Tập 55, Số 4, ngày 1 tháng 4 năm 2009, trang 611–622, https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797.
2. Thermo Fisher Scientific. Thiết lập PCR—Sáu thành phần quan trọng cần xem xét. https://www.thermofisher.com/us/en/home/lifescience/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-componentconsiderations.html.
3. Thermo Fisher Scientific. (2022). Sử dụng máy quang phổ NanoDrop One/OneC để xác định sự nhiễm DNA/RNA trong các mẫu axit nucleic nhằm kiểm soát chất lượng cho RT-qPCR/qPCR. Application Note 53596. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/ApplicationNotes/nanodrop-oneonec-spectrophotometer-dna-rna-contamination-en-an53596.pdf.
4. Thermo Fisher Scientific. (2022). Sử dụng máy quang phổ NanoDrop One/OneC để xác định các chất gây nhiễm phenol và protein trong axit nucleic cho kiểm soát chất lượng RT-qPCR. Application Note 53472. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/ApplicationNotes/nanodrop-one-phenolprotein-contaminants-rtqpcr-en-tn53472.pdf.
4. Thermo Fisher Scientific. (2017). Xác định chất nhiễm phenol Acclaro: Phát hiện phenol trong các mẫu axit nucleic bằng máy quang phổ NanoDrop One. Technical Note 52918. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/TN52918-Acclaro-Phenol-TechNoteNanoDrop-One.pdf.