Sử dụng NanoDrop One/OneC để xác định các chất tạp nhiễm phenol và protein trong axit nucleic phục vụ cho việc kiểm soát chất lượng RT-qPCR

Tóm tắt

Để có một thí nghiệm RT-qPCR chính xác, đáng tin cậy và thành công, cần phải xem xét một số yếu tố. Để bắt đầu, mẫu RNA phải được thêm vào các phản ứng ở nồng độ chính xác và không có chất gây ô nhiễm. Công nghệ Thermo Scientific™ Acclaro™ Sample Intelligence được tích hợp trong phần mềm Máy quang phổ UV-Vis Microvolume NanoDrop™ One/OneC của Thermo Scientific™ xác định các chất gây ô nhiễm như protein và thuốc thử chiết xuất còn lại bao gồm phenol. Trong thử nghiệm này, tác động của các thành phần như phenol, TRIzol, albumin huyết thanh bò (BSA) và hemoglobin (được bổ sung vào mẫu RNA) lên kết quả RT-qPCR được đánh giá cụ thể với sử dụng xét nghiệm BRCA1 TaqMan. Kết quả cho thấy các hóa chất bổ sung vào mẫu RNA gồm phenol, TRIzol và protein làm tăng chu kỳ định lượng (Cq) và gây ra sự không chính xác trong nồng độ hấp thụ. Lợi ích của công nghệ Acclaro trong việc xác định các chất tạp nhiễm trước khi thực hiện RT-qPCR và cung cấp nồng độ chính xác đã được hiệu chỉnh sẽ giúp tiết kiệm đáng kể thời gian và nguồn lực bằng cách ngăn chặn các phản ứng thất bại

Giới thiệu

PCR phiên mã ngược (RT-qPCR) là một kỹ thuật sinh học phân tử đã được thiết lập và sử dụng cho nhiều ứng dụng khác nhau bao gồm xét nghiệm biểu hiện gen. Theo hướng dẫn về Thông tin tối thiểu để công bố các thí nghiệm PCR định lượng thời gian thực (MIQE), việc duy trì kiểm soát chất lượng các mẫu RNA đóng vai trò quan trọng, nếu chúng ta muốn giảm thiểu sự thay đổi trong kết quả PCR. Kiểm soát chất lượng mẫu bao gồm việc duy trì mẫu RNA không bị tạp nhiễm với DNA và các hóa chất sử dụng trong quá trình tách chiết. Hướng dẫn MIQE đề xuất đo tỷ lệ A260/A280 để xác định độ tinh khiết của các mẫu RNA.¹ Mẫu RNA thường được coi là tinh khiết khi tỷ lệ A260/A280 có giá trị khoảng 2.0 và các chất phân tích gây ô nhiễm có thể ảnh hưởng đến giá trị này. Mặc dù tỷ lệ A260/A280 là một phương pháp thường dùng để xác định độ tinh khiết, tỷ lệ này không cung cấp thông tin chi tiết về danh tính chất gây tạp nhiễm vì hầu hết các vật liệu chiết xuất, chẳng hạn như phenol, hấp thụ trong cùng một vùng quang phổ với axit nucleic.

Hiện nay, với số lượng lớn các bộ kit và quy trình tách chiết axit nucleic trên thị trường, rất khó để xác định bộ kit hoặc quy trình nào cung cấp sản phẩm tách chiết axit nucleic tinh khiết nhất. Các thuốc thử sử dụng trong quá trình tách chiết có thể lẫn với axit nucleic và do đó, việc tối ưu quy trình để loại bỏ các chất tạp nhiễm này thường được yêu cầu trước khi thực hiện phản ứng RT-qPCR. Chất tạp nhiễm sẽ ảnh hưởng đến chu kỳ định lượng (Cq), do đó độ tinh khiết phải được xác định đúng cách trước khi axit nucleic được thêm vào hỗn hợp phản ứng.² Việc nhiễm Protein và Phenol có thể gây ức chế DNA polymerase trong quá trình khuếch đại PCR và phenol cũng có khả năng làm biến tính enzyme phiên mã ngược, cả hai trường hợp đều dẫn đến kết quả âm tính giả. Ngoài việc đảm bảo mẫu tinh khiết, phải xác định nồng độ chính xác để xác nhận lượng RNA khuôn mẫu chính xác được thêm vào giếng phản ứng. Hướng dẫn MIQE đề xuất đo nồng độ trước khi nạp mẫu vào đĩa PCR để đảm bảo tính đồng nhất giữa các lần lặp lại thí nghiệm.¹ Ngoài ra, một số vật liệu gây ô nhiễm, chẳng hạn như những vật liệu có trong bộ dụng cụ tách chiết thông thường, sẽ ước tính quá cao nồng độ axit nucleic. Nếu nồng độ mẫu không chính xác, kết quả sẽ khác nhau giữa các giếng hoặc nếu mẫu quá loãng, điều này có thể làm giảm khả năng liên kết mồi và ảnh hưởng đến kết quả RT-qPCR Cq. 5

Ưu điểm của máy quang phổ NanoDrop One trong quy trình RT-qPCR

Để giúp đảm bảo các mẫu axit nucleic không có chất gây ô nhiễm ảnh hưởng đến kết quả RT-qPCR, công nghệ Acclaro Sample Intelligence của Thermo Scientific xác định các chất gây ô nhiễm phổ biến trong chế phẩm axit nucleic và báo cáo nồng độ mẫu đã hiệu chỉnh (Hình 1). Công nghệ Acclaro được tích hợp vào phần mềm cục bộ của Máy quang phổ NanoDrop One/OneC và phần mềm PC. Phenol-chloroform- phương pháp tách chiết axit nucleic được coi là tiêu chuẩn vàng – có thể tạo ra RNA tinh khiết và không bị phân hủy nhưng thuốc thử sử dụng trong quy trình có thể bị lẫn với RNA được tách chiết.⁶ Một thuốc thử phổ biến khác thường được sử dụng trong quy trình tách chiết axit nucleic, TRIzol, chứa phenol và guanidine isothiocyanate, cũng được xác định trong chế phẩm RNA bằng công nghệ Acclaro.7 Phương pháp tách chiết dựa trên TRIzol tách RNA thành pha nước, DNA thành pha trung gian và protein thành pha hữu cơ.⁷ Các pha này có khả năng lẫn với nhau trong phương pháp tách chiết phenol-chloroform và TRIzol nếu kĩ thuật viên không cẩn thận khi thao tác pipet, dẫn đến axit nucleic được tách chiết có tạp nhiễm.

Ngoài các tính năng công nghệ Acclaro, Máy quang phổ NanoDrop One/OneC sử dụng phép đo mẫu thể tích nhỏ, bảo toàn RNA được tách chiết để tối ưu hóa cho quy trình RT-qPCR. Trong vòng chưa đầy 8 giây, thiết bị NanoDrop One/OneC báo cáo tỷ lệ độ tinh khiết A260/A280 và A260/A230 cùng với nồng độ mẫu mà không cần pha loãng, cung cấp thông tin chi tiết hữu ích trước phản ứng RT-qPCR. Hình 2 phác thảo các chất gây ô nhiễm được công nghệ Acclaro xác định cho các ứng dụng dsDNA và RNA. Phần mềm sẽ báo cáo các kết quả sau: 1-Nồng độ axit nucleic không áp dụng hiệu chỉnh thuật toán Acclaro; 2- Nồng độ mẫu đã hiệu chỉnh và 3- Bước sóng cụ thể của chất tạp nhiễm vào kết quả sau cùng.

Vật liệu và phương pháp

RNA từ tế bào lympho người (được tách chiết bởi BioChain, mã R1254148-1) đã được chuẩn bị bằng cách thẩm tách và pha loãng trong dung dịch đệm Tris-EDTA (TE) (Fisher BioReagents, pH 8.0, BP2473500). Mẫu RNA với nồng độ 25 ng/µL được bổ sung riêng biệt với phenol (Fisher BioReagents, BP1750B-65), albumin huyết thanh bò (Sigma Aldrich, A7284-50ML), hemoglobin (MP Biomedicals, 02100714-CF), và TRIzol (QIAzol từ Qiagen, 79306).

Các mẫu RNA đã được bổ sung sau đó được đo trên thiết bị NanoDrop One/OneC để xác định nồng độ RNA đã được hiệu chỉnh và nồng độ ban đầu sử dụng công nghệ Acclaro. Kết quả được thể hiện trong Hình 3. Nồng độ ban đầu chưa được hiệu chỉnh được pha loãng đến 25 ng/µL trước khi nạp vào dĩa qPCR để mô phỏng kết quả của máy quang phổ không sử dụng công nghệ Acclaro.

Thử nghiệm biểu hiện gen BRCA1 TaqMan® (Applied Biosystems, Hs01556193_m1) được sử dụng làm mục tiêu. BRCA1 đã được khuếch đại cho mỗi mẫu và được tiêu chuẩn hóa bằng cách sử dụng TaqMan™ Fast Virus 1-Step Master Mix (Applied Biosystems, 4444432). Phản ứng RT-qPCR được thực hiện trên hệ thống Thermo Scientific™ QuantStudio™ 6 Pro Real-Time PCR (Applied Biosystems, A43159).

Kết quả các mẫu RNA được bổ sung với phenol và protein

Sau khi các mẫu RNA được bổ sung với phenol, TRIzol, BSA và hemoglobin riêng biệt, các mẫu được đo với ứng dụng RNA trên Máy quang phổ NanoDrop One/OneC. Trong Hình 3, nồng độ RNA ban đầu và nồng độ đã hiệu chỉnh được cung cấp bởi công nghệ Acclaro. Nồng độ mẫu “đã hiệu chỉnh” được báo cáo bởi phần mềm Acclaro được sử dụng trong phép tính để pha loãng đến nồng độ mục tiêu 25 ng/ µL để nạp vào dĩa PCR. Tuy nhiên, nồng độ các mẫu “ban đầu” chưa qua hiệu chỉnh được sử dụng để pha loãng các mẫu đến nồng độ mục tiêu 25 ng/µL trong thực tế.

Sau khi hoàn thành RT-qPCR, đường cong chuẩn cho kết quả R² là 0,998 với hiệu suất 97,5%. Thiết kế QuantStudio và Phần mềm Phân tích tính toán giá trị trung bình Cq và các giá trị được thể hiện trong Hình 4 và 5.

Trong thí nghiệm với phenol và TRIzol, mẫu đối chứng có giá trị Cq là 24. Mẫu RNA được bổ sung phenol có giá trị Cq là 28.5 với nồng độ ban đầu và 26.6 với nồng độ đã hiệu chỉnh. Đối với TRIzol, giá trị Cq của nồng độ ban đầu là 25.3 và 23.8 với nồng độ đã hiệu chỉnh. Trong các thí nghiệm với protein, mẫu đối chứng có giá trị Cq là 24. Mẫu RNA bổ sung BSA có giá trị Cq là 31.4 với nồng độ ban đầu và 27.4 với nồng độ đã hiệu chỉnh. Đối với hemoglobin, giá trị Cq của nồng độ ban đầu là 28.8 và 27.9 khi nồng độ đã hiệu chỉnh được ước tính là 100 ng/µL.

Phần kết luận

Một thí nghiệm RT-qPCR chính xác đòi hỏi nồng độ ban đầu của mẫu RNA cụ thể và không có chất tạp nhiễm. Kiểm soát chất lượng cần được thực hiện trước khi tiến hành các ứng dụng tiếp theo vì các chất tạp nhiễm có thể thay đổi nồng độ mẫu, từ đó ảnh hưởng đến giá trị Cq của phản ứng PCR. Trước đây, tỷ lệ A260/A280 được sử dụng như là tiêu chí kiểm soát chất lượng cho RT-qPCR, và mặc dù tỷ lệ này có thể xác định độ tinh khiết của axit nucleic, nó không cung cấp thông tin về các chất tạp nhiễm.

Công nghệ Acclaro được tích hợp trong thiết bị NanoDrop One/OneC có khả năng xác định các chất gây nhiễm và cung cấp nồng độ mẫu đã được hiệu chỉnh. Thông tin về chất tạp nhiễm giúp cung cấp các chi tiết hữu ích cho người thực hiện thí nghiệm, từ đó có thể tối ưu hóa quy trình trước khi tiến hành RT-qPCR. Các kết quả nêu trên nhấn mạnh độ nhạy cao của RT-qPCR đối với sự nhiễm protein hoặc phenol trong các mẫu RNA. Khi nồng độ phenol hoặc protein tăng lên, nồng độ RNA bị đánh giá cao hơn thực tế, và giá trị Cq cũng tăng do lượng mẫu ban đầu giảm qua các bước pha loãng.

Do phenol và protein là những chất ức chế enzyme polymerase, không thể mong đợi rằng giá trị Cq sẽ tương tự với mẫu đối chứng khi sử dụng nồng độ đã được hiệu chỉnh. Tuy nhiên, phần mềm Acclaro vẫn cung cấp các dữ liệu quan trọng về sự tạp nhiễm cho người dùng trước khi thực hiện RT-qPCR. Việc tích hợp thiết bị NanoDrop One/OneC vào quy trình kiểm soát chất lượng RT-qPCR sẽ tiết kiệm thời gian và tài nguyên quý giá cho các ứng dụng quy mô lớn.

Tài liệu tham khảo:

• 1. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT (2009). Hướng dẫn MIQE: thông tin tối thiểu để công bố các thí nghiệm PCR thời gian thực định lượng. Clin Chem. 55 (4): 611-22.
• 2. Tan, S. C., & Yiap, B. C. (2009). Tách chiết DNA, RNA và protein: quá khứ và hiện tại. Tạp chí y sinh học & công nghệ sinh học, 2009, 574398. https://doi.org/10.1155/2009/574398.
• 3. Toni, L. S., Garcia, A. M., Jeffrey, D. A., Jiang, X., Stauffer, B. L., Miyamoto, S. D., & Sucharov, C. C. (2018). Tối ưu hóa việc tách chiết RNA bằng phenol-chloroform. MethodsX, 5, 599–608. https://doi.org/10.1016/j.mex.2018.05.011.
• 4. Bélec, L., Authier, J., Eliezer-Vanerot, M. C., Piédouillet, C., Mohamed, A. S., & Gherardi, R. K. (1998). Myoglobin như một chất ức chế phản ứng chuỗi polymerase (PCR): một hạn chế đối với PCR từ mô cơ xương được tránh bằng cách sử dụng polymerase Thermus thermophilus. Muscle & nerve, 21(8), 1064–1067. https://doi.org/10.1002/(sici)1097 4598(199808)21:8<1064::aid-mus11>3.0.co;2-u.
• 5. Sean C. Taylor, Katia Nadeau, Meysam Abbasi, Claude Lachance, Marie Nguyen, Joshua Fenrich, Thí nghiệm qPCR cuối cùng: Lần đầu tiên nghiên cứu chất lượng, có thể tái lập được công bố, Trends in Biotechnology, Tập 37, Số 7, 2019, Trang 761-774, ISSN 0167-7799, https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.12.002.
• 6. Chomczynski, P. và Sacchi, N. “Phương pháp đơn bước để tách chiết RNA bằng guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform.” Anal. Biochem. 162: 156-159. 1987.
• 7. Chomczynski P. Một thuốc thử để tách chiết RNA, DNA và protein từ mẫu tế bào và mô trong một bước. Biotechniques. 1993 Tháng 9;15(3):532-4, 536-7.