Sử dụng thiết bị quang phổ NanoDrop One/OneC để nhận diện tạp nhiễm DNA/RNA trong mẫu nucleic acidcho quy trình quản lý chất lượng ứng dụng RT-qPCR/qPCR

Tóm tắt

Máy quang phổ UV-Vis NanoDrop™ One/OneC của Thermo Scientific™ có thể được tích hợp dễ dàng vào quy trình qPCR/RTqPCR để kiểm tra chất lượng nucleic acid. Khi thực hiện thí nghiệm PCR, mẫu nucleic acid phải được thêm vào với nồng độ cụ thể và không nhiễm tạp chất. Công nghệ Thermo Scientific™ Acclaro™ Sample Intelligence tích hợp trong thiết bị NanoDrop One/OneC có khả năng nhận dạng được RNA hoặc DNA có trong mẫu DNA hoặc RNA, tương ứng. Trong nghiên cứu này, tác động của tạp nhiễm nucleic acid đến kết quả qPCR và RT-qPCR đã được khảo sát sau khi bổ sung và mẫu nucleic acid một lượng RNA hoặc DNA tạp nhiễm, gen mục tiêu là BRCA1. Kết quả chỉ ra rằng việc tạp nhiễm nucleic acid làm tăng chu kỳ định lượng (Cq) và làm phóng đại giá trị hấp thụ và nồng độ.

Thiết bị NanoDrop One/OneC, cùng với các tính năng của công nghệ Acclaro, đảm bảo mẫu nucleic acid tinh sạch và với nồng độ chính xác cho các thí nghiệm qPCR và RT-qPCR, giúp tiết kiệm thời gian và công sức cho các thí nghiệm không thành công.

Giới thiệu

Theo hướng dẫn của MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments), việc kiểm soát chất lượng mẫu nucleic acid là rất quan trọng để tránh sai lệch trong kết quả PCR.¹ Kiểm soát chất lượng bao gồm việc đảm bảo rằng sản phẩm RNA không chứa DNA và sản phẩm DNA không có RNA. MIQE đề xuất sử dụng tỷ lệ độ tinh sạch A260/A280 như một phương pháp đánh giá độ tinh sạch của mẫu nucleic acid sau khi tách chiết.¹ Trước đây, tỷ lệ này được dùng để xác định độ tinh sạch của mẫu DNA và RNA, với tỷ lệ A260/A280 khoảng ~1,8 đối với DNA và ~2,0 đối với RNA trước khi thực hiện qPCR hoặc RT-qPCR. Tuy nhiên, các máy quang phổ truyền thống không thể phát hiện các tạp chất có cùng bước sóng hấp thụ ở 260 nm với mẫu mục tiêu, như tạp nhiễm DNA trong mẫu RNA. Hạn chế này có thể khiến các nhà nghiên cứu ước tính nồng độ mẫu nucleic acid cao hơn thực tế và lẫn tạp nhiễm, từ đó ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả qPCR hoặc RT-qPCR.²

Ưu điểm của thiết bị NanoDrop One khi ứng dụng vào quy trình RT-qPCR và qPCR

Để đảm bảo các mẫu nucleic acid chứa các tạp nhiễm ảnh hưởng đến kết quả qPCR/RT-qPCR, công nghệ Acclaro nhận diện các tạp chất phổ biến trong các sản phẩm nucleic acid và báo cáo nồng độ mẫu đã được hiệu chỉnh (Hình 1). Công nghệ Acclaro được tích hợp vào phần mềm của thiết bị NanoDrop One/OneC.

Hình 2 cho thấy các tạp chất mà công nghệ Acclaro có thể nhận dạng cho các ứng dụng đo dsDNA và RNA. Phần mềm sẽ báo cáo nồng độ ban đầu không áp dụng hiệu chỉnh nào từ thuật toán Acclaro, nồng độ mẫu sau khi được hiệu chỉnh, và đóng góp vào độ hấp thụ của tạp chất đối với bước sóng phân tích.

Ngoài các tính năng của công nghệ Acclaro, máy quang phổ NanoDrop One/OneC còn sử dụng phương pháp đo mẫu vi lượng, giúp bảo toàn lượng sản phẩm nucleic acid đã tách chiết cho các quy trình tiếp theo. Trong chưa đầy 8 giây, thiết bị NanoDrop One/OneC sẽ báo cáo tỷ lệ độ tinh sạch A260/A280 và A260/A230 cùng với nồng độ mẫu mà không cần pha loãng, cung cấp thông tin hữu ích trước khi thực hiện phản ứng PCR.

Vật liệu và phương pháp

Với phản ứng RT-qPCR, RNA tổng từ tế bào lympho người (tách chiết bằng BioChain, R1254148-1) và DNA bộ gen (tách chiết bằng BioChain, D1234999-G01) được chuẩn bị bằng cách lọc và hoàn nguyên trong dung dịch Tris-EDTA (TE) (Fisher BioReagents, pH 7.6, BP2474500). Mẫu RNA 100 ng/µL được bổ sung 25 ng/µL DNA bộ gen. Gen BRCA1 được khếch đại bằng bộ kit TaqMan™ RNA-to-CT™ 1-Step (Applied Biosystems, 4392653) và BRCA1 TaqMan® Gene Expression Assay (assay ID Hs01556193_m1).

Với phản ứng qPCR, DNA bộ gen từ tế bào ung thư người (tách chiết bằng BioChain, D1255811) và RNA tổng từ tế bào lympho người (tách chiết bằng BioChain, R1254148-1) được chuẩn bị bằng cách lọc và hoàn nguyên trong dung dịch Tris-EDTA (TE) (Fisher BioReagents, pH 7.6, BP2474500). Mẫu DNA 100 ng/µL được bổ sung 50 ng/µL RNA. Gen BRCA1 được khuếch đại bằng bộ kit PrimeTime™ Gene Expression Master Mix cho qPCR (Integrated DNA Technologies, Inc., 1055770), và các mồi cùng probe cho BRCA1 được thiết kế bằng công cụ PrimerQuest™ của Integrated DNA Technologies, Inc.

Các mẫu RNA và DNA này sau đó được đo trên thiết bị NanoDrop One/OneC để xác định nồng độ trước và sau khi hiệu chỉnh bởi công nghệ Acclaro (Hình 3). Các nồng độ ban đầu và sau khi hiệu chỉnh sau đó được pha loãng đến 25 ng/µL trước khi đưa vào máy qPCR.

Phản ứng RT-qPCR và qPCR được thực hiện trên hệ thống QuantStudio™ 6 Pro Real-Time PCR System (Applied Biosystems, A43159).

Tạp nhiễm DNA trong sản phẩm RNA

Việc tạp nhiễm DNA bộ gen (gDNA) là một mối quan tâm lớn đối với mẫu RNA, vì việc khuếch đại gDNA có thể xảy ra song song với cDNA trong quá trình PCR, dẫn đến việc định lượng không chính xác sau khi phiên mã ngược. Với phương pháp quang phổ truyền thống, dsDNA và RNA không thể phân biệt được vì chúng cùng hấp thụ tại bước sóng 260 nm, làm tăng nồng độ đo được. Nồng độ tăng này khiến người thao tác pha loãng RNA quá mức cho RTqPCR. Với nồng độ RNA quá loãng, sẽ có sự biến động cao giữa các bản sao do hiệu ứng ngẫu nhiên hoặc sự ức chế quá trình khuếch đại. Hình 4 cho thấy tác động lên Cq khi RNA được bổ sung gDNA. Cq cho cả nồng độ đã được hiệu chỉnh và nồng độ ban đầu đều tăng so với mẫu đối chứng. Cq của nồng độ đã được hiệu chỉnh vẫn cao hơn mẫu đối chứng vì tạp nhiễm gDNA vẫn còn trong mẫu.

Công nghệ Acclaro là một công cụ hữu ích để xác định tạp nhiễm DNA trong mẫu RNA, nhưng kết quả khuyến cáo rằng mẫu RNA cần phải được tinh sạch trước khi thực hiện qPCR để tăng độ chính xác. Để giảm thiểu tác động của việc tạp nhiễm gDNA lên Cq, Bustin (2002) khuyến nghị thực hiện xử lý DNase trước RT-qPCR. Sau khi hoàn tất xử lý DNase, người dùng có thể đo lại mẫu trên thiết bị NanoDrop One/OneC để xác định độ tinh sạch và nồng độ của mẫu RNA trước khi tiến hành các ứng dụng tiếp theo.

Tạp nhiễm RNA trong sản phẩm DNA

Các sản phẩm DNA sau tách chiết thường xuyên lẫn tạp nhiễm RNA với tỷ lệ từ 28-52% tùy thuộc vào loại mô, theo nghiên cứu của Sanchez et al. (2015). Tình trạng này dẫn đến việc ước lượng nồng độ DNA cao hơn thực tế khi đo bằng các máy quang phổ UV-Vis. Tạp nhiễm RNA có thể gây ra sự biến động trong kết quả qPCR, vì phương pháp này yêu cầu lượng DNA đầu vào phải được chuẩn hóa giữa các giếng lặp lại, điều này tạo ra khó khăn khi nồng độ DNA bị ước lượng quá cao do sự hiện diện của tạp nhiễm. Hình 5 minh họa tác động lên Cq khi gDNA được bổ sung RNA, trong đó Cq bị nâng cao với nồng độ ban đầu và trở lại bình thường khi sử dụng nồng độ đã được điều chỉnh. Kết quả cho thấy nồng độ DNA được điều chỉnh bởi công nghệ Acclaro giúp phục hồi Cq về mức đối chứng. Tuy nhiên, khuyến nghị vẫn là tinh sạch DNA trước khi thực hiện qPCR để đảm bảo kết quả chính xác và có thể tái lặp được. Sanchez et al. (2015) đề xuất bước xử lý RNase trước khi thực hiện qPCR để loại bỏ RNA tạp nhiễm trong mẫu DNA. Độ tinh sạch và nồng độ của dsDNA có thể được đo trên thiết bị NanoDrop One/OneC để định lượng chính xác trước khi thực hiện phản ứng qPCR.

Kết luận

Sự biến động trong kết quả qPCR hoặc RT-qPCR do mẫu nucleic acid bị tạp nhiễm có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến những ứng dụng chẩn đoán lâm sàng hoặc xét nghiệm di truyền, nơi mà độ chính xác trong việc định lượng rất quan trọng. Máy quang phổ NanoDrop One/OneC có thể được tích hợp trực tiếp vào quy trình RT-qPCR hoặc qPCR, giúp kiểm tra và đảm bảo rằng mẫu nucleic acid không bị tạp nhiễm DNA hoặc RNA. Các máy quang phổ truyền thống không thể phân biệt giữa RNA và dsDNA, vì cả hai đều hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm. Tuy nhiên, với công nghệ Acclaro tích hợp vào thiết bị NanoDrop One/OneC, người dùng có thể xác định nồng độ chính xác của nucleic acid mục tiêu cũng như các tạp nhiễm, từ đó giúp tiết kiệm thời gian, công sức và hóa chất trong các bước chuẩn bị PCR định lượng tiếp theo.

References

• 1. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT (2009). The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4): 611-22.
• 2. Hashemipetroudi, S. H., Nematzadeh, G., Ahmadian, G., Yamchi, A., & Kuhlmann, M. (2018). Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA. Journal of visualized experiments: JoVE, (131), 55451. https://doi.org/10.3791/55451.
• 3. Bustin S. A. (2002). Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of molecular endocrinology, 29(1), 23–39. https://doi.org/10.1677/jme.0.0290023.
• 4. Sanchez, I., Remm, M., Frasquilho, S., Betsou, F., & Mathieson, W. (2015). How Severely Is DNA Quantification Hampered by RNA Co-extraction?. Biopreservation and biobanking, 13(5), 320–324. https://doi.org/10.1089/bio.2015.0008.