Sản xuất vaccine mRNA: Đảm bảo kiểm soát chất lượng với máy quang phổ NanoDrop

Giới thiệu

Trong thời kỳ đỉnh điểm của đại dịch SARS-CoV-2, vaccine mRNA ngày càng trở nên phổ biến trong cuộc chiến chống lại đại dịch nhờ vào tính an toàn, hiệu quả và khả năng sản xuất nhanh chóng. Vaccine mRNA hoạt động bằng cách huấn luyện tế bào sản xuất một protein ngoại lai đủ để kích thích phản ứng miễn dịch. Phản ứng miễn dịch sau đó kích hoạt sự phát triển của các kháng thể đặc hiệu với protein mục tiêu, tiêu diệt các virus gây bệnh khi chúng xâm nhập vào cơ thể trong tương lai. Trong ghi chú này, việc sử dụng máy quang phổ UV-Vis NanoDrop One/OneC hoặc NanoDrop Eight trong quy trình sản xuất vaccine mRNA được điều tra như một điểm kiểm soát chất lượng.

Giải trình tự

Sản xuất vaccine mRNA bắt đầu bằng việc tách chiết nucleic acid và chuẩn bị cho quá trình giải trình tự. Để thực hiện thành công việc giải trình tự nucleic acid , chất lượng và số lượng của vật liệu đầu vào là rất quan trọng. Phòng Thí nghiệm Genomics Core tại Đại học Pennsylvania yêu cầu RNA tổng hợp cho việc giải trình tự phải hoàn toàn không có tạp chất, vì bất kỳ vật liệu ngoại lai nào cũng có thể gây ra “biến thể… trong hồ sơ phiên mã.” Với số lượng lớn bộ kit và quy trình tách chiết nucleic acid có sẵn, nồng độ thu được và độ tinh sạch có thể khác nhau tùy thuộc vào từng bộ kit hoặc quy trình. Việc sử dụng máy quang phổ NanoDrop One/OneC hoặc NanoDrop Eight sau bước tách chiết nucleic acid có thể đóng vai trò là điểm kiểm soát chất lượng trước khi tiến hành giải trình tự

Công nghệ Thermo Scientific™ Acclaro™ Sample Intelligence Technology, được tích hợp trong máy NanoDrop One/OneC và phần mềm máy quang phổ NanoDrop Eight, đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát chất lượng. Trước đây, tỷ lệ tinh sạch của nucleic acid như A260/A280 và A260/A230 được sử dụng như phương pháp để đánh giá độ tinh sạch. Tuy nhiên, trong các phép đo quang phổ UV-Vis truyền thống, bất kỳ vật liệu nào hấp thụ tại bước sóng phân tích đều có thể ảnh hưởng đến tổng độ hấp thụ và tính toán nồng độ. Ví dụ, dsDNA bị nhiễm bẩn trong một mẫu RNA sẽ cùng hấp thụ tại 260 nm, dẫn đến việc ước lượng nồng độ bị tăng lên. Để khắc phục nhược điểm này, Công nghệ Acclaro sử dụng các thuật toán chemomatrics để phân biệt giữa RNA và dsDNA cũng như các tạp chất phổ biến như phenol. Công nghệ Acclaro hỗ trợ người dùng trong quy trình giải trình tự vì RNA bị tạp nhiễm sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp thư viện. Sau khi giải trình tự thành công, trình tự mục tiêu dùng cho tổng hợp vaccine sẽ được xác định và quá trình sản xuất plasmid tiếp tục.

Sản xuất plasmid

Sau khi hoàn tất quá trình giải trình tự, DNA plasmid tái tổ hợp được tổng hợp bằng cách chèn gen mục tiêu vào plasmid thông qua các enzyme cắt giới hạn và DNA ligase. Plasmid tái tổ hợp sau đó được chuyển vào Escherichia coli (E. coli), nơi các tế bào vi khuẩn sẽ được chọn lọc dựa trên tính kháng kháng sinh hoặc sàng lọc màu sắc khuẩn lạc. Sau khi chọn lọc và nuôi cấy các khuẩn lạc chứa plasmid, OD 600 của môi trường nuôi cấy được đo trên máy quang phổ NanoDrop để xác định xem mật độ có phù hợp cho việc tinh chế plasmid hay không, thường nằm trong khoảng 2.0–4.0 OD ở 600 nm, tùy thuộc vào bộ kit tinh chế.

Tiếp theo, plasmid được tinh chế từ môi trường nuôi cấy bằng một bộ kit để loại bỏ DNA bộ gen hoặc các tạp chất khác. Các muối hoặc protein nhiễm bẩn sẽ ảnh hưởng đến thành công của các thí nghiệm tiếp theo, dẫn đến thất bại và buộc người dùng phải khắc phục sự cố, điều này tốn thời gian và chi phí. Để giảm thiểu việc khắc phục sự cố sau các thí nghiệm thất bại, plasmid đã tinh chế được đo trên máy quang phổ NanoDrop One/OneC hoặc NanoDrop Eight, nơi mà các thuật toán Công nghệ Acclaro có thể xác định các tạp chất còn sót lại sau quá trình tinh chế. Các biện pháp kiểm soát chất lượng bổ sung cho sản xuất plasmid có thể dễ dàng được thực hiện với máy quang phổ NanoDrop để cung cấp dữ liệu phổ đầy đủ trong vòng mười lăm giây hoặc ít hơn, tùy thuộc vào dòng thiết bị.

Tổng hợp mRNA: phiên mã In vitro

Khi plasmid tái tổ hợp được xác nhận là tinh sạch từ việc đo trên máy quang phổ NanoDrop, plasmid sẽ được phân đoạn và polymerase bắt đầu quá trình phiên mã gen mục tiêu. Polymerase tổng hợp mRNA từ mẫu DNA và mRNA được xử lý để đảm bảo quá trình dịch mã protein diễn ra hiệu quả. Khi quá trình tổng hợp mRNA hoàn tất, DNA sẽ bị phân hủy bằng DNase, và mRNA sẽ trải qua một lần tinh chế cuối cùng để loại bỏ các tạp chất từ quá trình phiên mã. Là một bước kiểm soát chất lượng cuối cùng với máy quang phổ NanoDrop, mRNA đã tinh chế được kiểm tra độ tinh sạch trước khi chiết dung dịch mRNA vào các lọ vaccine.

Công nghệ Acclaro có sẵn trên máy quang phổ NanoDrop One/OneC và NanoDrop Eight cung cấp một bước kiểm soát chất lượng nâng cao sau quá trình tổng hợp. Việc xác định độ tinh sạch của mRNA cuối cùng là rất quan trọng, vì tạp chất có thể làm giảm hiệu lực của vaccine thông qua việc ức chế dịch mã protein. Việc nhận diện tạp chất và các tính năng hỗ trợ xử lý hữu ích của Công nghệ Acclaro loại bỏ sự suy đoán khi xác định độ tinh sạch từ các tỷ lệ A260/A280 và A260/A230, đảm bảo sản phẩm mRNA cuối cùng hoàn toàn tinh sạch.

Kết luận

Máy quang phổ NanoDrop One/OneC và NanoDrop Eight nâng cao các cơ chế kiểm soát chất lượng trong quá trình sản xuất vaccine mRNA từ đầu đến cuối. Tính năng điều chỉnh chiều dài quang tự động của tất cả các máy quang phổ NanoDrop cho phép người dùng đo nồng độ trong khoảng rất rộng chỉ với 1–2 µL mà không cần phải pha loãng mẫu, và có thể hoàn thành trong 15 giây hoặc ít hơn, tùy thuộc vào dòng thiết bị.

Phần mềm có sẵn cho máy quang phổ NanoDrop One/OneC và NanoDrop Eight cho phép người dùng tuân thủ 21 CFR Part 11, khiến các thiết bị này sẵn sàng được triển khai vào quy trình sản xuất vaccine mRNA tại các phòng thí nghiệm GMP. Việc bổ sung Công nghệ Acclaro tích hợp trong phần mềm cho phép người dùng xác định tạp chất và cung cấp các bước xử lý sự cố được đề xuất, giúp tiết kiệm chi phí và thời gian từ việc lặp lại các thí nghiệm thất bại. Với sự quan tâm ngày càng tăng đối với vaccine mRNA, các máy quang phổ NanoDrop cung cấp một phương pháp nhanh chóng và đơn giản để cải thiện kiểm soát chất lượng.

Tài liệu tham khảo

1. Pardi, N., Hogan, M., Porter, F. et al. mRNA vaccines—a new era in vaccinology. Nat Rev Drug Discov 17, 261–279 (2018). https://doi.org/10.1038/nrd.2017.243
2. CDC—National Center for Immunization and Respiratory Diseases – Understanding mRNA COVID-19 Vaccines. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/vaccines/ different-vaccines/mrna.html. November 17, 2021.
3. The Pennsylvania State University. (n.d.). RNA-seq sample guidelines—the Huck Institutes. Genomics Core Facility. https://www.huck.psu.edu/core-facilities/genomicscore-facility/sample-recommendations/rna-seq-sample-guidelines. November 19, 2021.
4. Cohen, S. N., Chang, A. C., Boyer, H. W., & Helling, R. B. (1973). Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 70(11), 3240–3244. https://doi.org/10.1073/pnas.70.11.3240
5. Steve Pascolo (2004) Messenger RNA-based vaccines, Expert Opinion on Biological Therapy, 4:8, 1285-1294. https://doi.org/10.1517/14712598.4.8.1285