Sử dụng thuật toán UV-Vis tiên tiến để tăng độ đặc hiệu

Nhận diện tạp nhiễm RNA trong mẫu DNA động vật có vú

Giới thiệu

Phương pháp định lượng nucleic acid truyền thống dựa trên việc xác định độ hấp thụ ở 3 bước sóng phân tích: 230 nm, 260 nm, and 280 nm. Thông tin thu nhận từ độ hấp thụ này cho phép các nhà khoa học tính toán được nồng độ nucleic acid và đánh giá được độ tinh sạch của mẫu. Một hạn chế của phương pháp này là thiếu độ đặc hiệu . Do đó, bất kỳ tạp chất nào hấp thụ ở các bước sóng này sẽ gây ra các sự sai khác về nồng độ nucleic acid có trong mẫu.

Thiết bị quang phổ củaThermo Scientific™-NanoDrop™ One/OneC được tích hợp phần mềm Thermo Scientific™ Acclaro™ Intelligence Technology sử dụng dữ liệu quang phổ và các thuật toán tiên tiến để nhận diện các tạp chất trong mẫu nucleic acid và tính toán được nồng độ nucleic acid sau hiệu chỉnh. Trong tài liệu này, chúng tôi sẽ trình bày cách tính năng mới được giới thiệu trong phần mềm Acclaro cho phép người dùng nhận dạng và hiệu chỉnh tạp nhiễm RNA trong mẫu DNA hoặc tạp nhiễm DNA trong mẫu RNA.

Vật liệu và phương pháp

DNA và RNA được ly trích từ tế bào HeLa, và được xử lý với RNase hoặc DNase để loại bỏ các tạp nhiễm nucleic acid khác, và được lọc trong dung dịch TE, pH 8.0. Nồng độ ban đầu các mẫu được xác định bằng thiết bị NanoDrop One với dung dịch blank là TE. Nhiều hỗn hợp DNA và RNA được chuẩn bị (trong hình 1), mỗi mẫu được đo 3 lần. Một aliquot 2,0 µL mới của hỗn hợp phù hợp được sử dụng cho mỗi lần đo lặp lại. Các kết quả nồng độ DNA được tính toán:

• Nồng độ DNA theo lý thuyết: Độ hấp thụ bước sóng A260 sau hiệu chỉnh nền A260 *50 ng/µL*(%DNA/100)
• Nồng độ DNA chưa hiệu chỉnh: Độ hấp thụ bước sóng A260 sau hiệu chỉnh nền A260 *50 ng/µL.
• Nồng độ DNA đã qua Acclaro: Độ hấp thụ bước sóng A260 sau hiệu chỉnh bằng Acclaro *50 ng/µL.
  Nồng độ DNA lý thuyết, chưa hiệu chuẩn và sau hiệu chuẩn với Acclaro được so sánh cùng nhau với bộ kit chuyên sử dụng để định lượng DNA bằng phương pháp huỳnh quang.

Một đường chuẩn được dựng theo đúng quy trình bộ kit. Các chuẩn được chuẩn bị bằng cách thêm 10 µL DNA chuẩn vào 200 µL dung dịch hoạt động. Các mẫu Nucleic acid được chuẩn bị bằng cách thêm 2.0 µL mẫu vào 200 µL dung dịch hoạt động. Sau đó các ống này được ủ ở nhiệt dộ phòng trong 5 phút và đo trên thiết bị đọc huỳnh quang. Các số liệu nồng độ DNA trung bình và độ lệch chuẩn từng mẫu được trình bày trong hình 1.

Kết quả

Khi tính toán nồng độ DNA trong mẫu chứa tạp nhiễm RNA, kết quả sẽ bị sai lệch nếu chỉ dựa vào độ hấp thụ ở bước sóng A260. Cả hai đại phân tử (DNA và RNA) đều hấp thụ ánh sáng ở bước sóng A260. Do đó, nếu chỉ sử độ hấp thụ bước sóng A260 để tính nồng độ DNA có thể dẫn đến ước tính nồng độ cao hơn lượng thực có trong các mẫu DNA bị tạp nhiễm với RNA.

Kết quả sau khi được hiệu chỉnh bằng Acclaro (các cột màu xanh lục) cho thấy sự chính xác rất cao khi ứng dụng trong việc đo các mẫu DNA bị tạp nhiễm RNA Thuật toán Acclaro sử dụng toàn bộ dữ liệu biểu đồ quang phổ kết hợp cùng các phân tích thống kê toán học để xác định đúng được lượng DNA thực có trong hỗn hợp DNA/RNA. Nồng độ DNA sau khi hiệu chỉnh bằng Acclaro gần như tường đồng với nồng độ DNA khi sử dụng hóa chất nhuộm huỳnh quang đặc hiệu với DNA.

Kết luận

Tạp nhiễm RNA trong các mẫu DNA là một vấn đề thường thấy trong các quy trình thí nghiệm hoặc xét nghiệm liên quan đến sinh học phân tử. Khi sử dụng phương pháp quang phổ truyền thống để xác định nồng độ mẫu, các RNA nhiễm trong mẩu sẽ làm tăng nồng độ DNA thực tế có trong mẫu. Mặc dù sử dụng các hóa chất nhuộm huỳnh quang gắn đặc hiệu với DNA có thể xác định được nồng độ DNA thực có chính xác hơn so với nếu chỉ sử dụng độ hấp thụ A260, việc mẫu DNA chứa tạp nhiễm RNA vẩn sẽ gây ảnh hưởng tiêu cực đến các quy trình.

Chúng tôi đã chứng minh rằng bằng cách sử dụng toàn bộ dữ liệu biểu đồ quang phổ kết hợp cùng các phân tích thống kê toán học, các nhà nghiên cứu có thể khắc phục những nhược điểm của cả hai phương pháp đã đề cập. Phần mềm Acclaro cho phép máy quang phổ NanoDrop One nhận dạng tạp nhiễm RNA trong mẫu DNA và cung cấp kết quả nồng độ đã được hiệu chỉnh. Hai yếu tố này sẽ giúp các nhà nghiên cứu nhanh chóng khắc phục vấn đề trong các lần tách chiết và cải thiện kết quả các quy trình tiếp theo.