Máy quang phổ NanoDrop Lite Plus

Đánh giá độ tinh khiết của DNA nhằm kiểm soát chất lượng nhân bản phân tử

Nhân bản phân tử yêu cầu hai thành phần chính để tạo ra DNA tái tổ hợp: 1) DNA vector; và 2) một hoặc nhiều đoạn DNA chứa gen quan tâm (gene of interest). Để tạo ra một đoạn DNA chứa GOI, quá trình cắt bằng enzyme endonuclease sẽ cắt DNA tại các vị trí đặc hiệu, tạo ra sự bổ sung ghép cặp với vectơ được cắt tương tự thông qua các đầu gắn kết của chúng (Hình 1A). Sau đó, vectơ và đoạn DNA được nối tại các đầu gắn kết của chúng bằng enzyme ligase để hình thành DNA tái tổ hợp (Hình 1B).1-3.

Kiểm soát chất lượng (QC) trong quá trình nhân bản phân tử rất quan trọng trước và sau bước cắt giới hạn. Sau khi tách chiết từ dòng tế bào, độ tinh khiết của plasmid DNA cần được kiểm tra trước khi tiến hành quá trình cắt. Các chất tạp nhiễm phổ biến trong quá trình tách chiết DNA bao gồm phenol, ethanol và muối, được biết đến với khả năng ức chế enzyme endonuclease và cản trở quá trình cắt chính xác. Sau khi cắt, hiệu quả của quá trình có thể được đánh giá bằng điện di gel agarose thông qua cách xác nhận sự xuất hiện của các dải DNA mong đợi và ít hoặc không có hiện tượng nhòe.

Việc sử dụng enzyme endonuclease sẽ tạo ra nhiều phân đoạn DNA có độ dài khác nhau khi cố gắng sao chép một gene đơn lẻ từ bộ gene DNA. Do đó, DNA đã được cắt thường được phân tích bằng điện di trên gel để xác định đoạn DNA chứa gene mục tiêu (GOI), sau đó đoạn DNA này được cắt và tinh sạch khỏi gel để thực hiện các bước nối và chuyển đổi về sau. Độ tinh khiết và nồng độ cũng cần được xác định sau khi tinh sạch từ gel nhằm đảm bảo hiệu quả cao trong quá trình nối và chuyển đổi.

Độ tinh khiết và nồng độ của plasmid DNA được tách chiết thường được đánh giá thông qua phương pháp quang phổ UV-Vis, do đây là một kỹ thuật nhanh chóng và đơn giản. DNA hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 260nm trong vùng UV, trong khi muối hấp thụ bước sóng dưới 230nm và protein hoặc hợp chất phenol hấp thụ khoảng 280nm. Độ hấp thụ đo được có thể liên quan đến nồng độ DNA thông qua Định luật Beer-Lambert, được thể hiện trong phương trình sau:

A = εbc

trong đó “c” = nồng độ, “A” = độ hấp thụ ở độ dài đường quang 1,0 cm, “ε” = hệ số hấp thụ đặc trưng cho mẫu và “b” = độ dài đường quang (thường là 1,0 cm): Sử dụng ba mẫu DNA plasmid pUC19 (Thermo Scientific, SD0061) đã được chuẩn bị. Mẫu 1 là pUC19 tinh khiết, trong khi mẫu 2 và 3 là pUC19 được thêm vào 150 ppm phenol và 20 mM EDTA tương ứng, nhằm mô phỏng sự tạp nhiễm thường gặp trong quá trình chiết xuất DNA thông thường. Nồng độ, tỷ lệ độ tinh khiết A260/A280 và tỷ lệ độ tinh khiết A260/A230 của cả ba mẫu được xác định bằng cách sử dụng thể tích 2,0 µL mỗi mẫu trên máy quang phổ NanoDrop Lite Plus với loại mẫu dsDNA.

Tỷ lệ độ tinh khiết A260/A230 và A260/A280 giảm do sự hiện diện của muối và protein. Do đó, các tỷ lệ này trở thành công cụ quan trọng trong việc đánh giá độ tinh khiết của DNA. Đối với dsDNA, tỷ lệ A260/A280 mong đợi là khoảng 1,8, trong khi tỷ lệ A260/A230 dự kiến nằm trong khoảng 2,0 – 2,2.
Máy quang phổ Thermo Scientific™ NanoDrop™ Lite Plus Microvolume có khả năng cung cấp tỷ lệ tinh khiết và nồng độ DNA cho các mẫu với thể tích chỉ từ 1,0 đến 2,0 µL. Việc phân tích các thể tích nhỏ như vậy rất quan trọng, cho phép bảo quản vật liệu mẫu cho các thí nghiệm tiếp theo, vì hầu hết các quy trình tách chiết DNA thường thu được hoặc hòa tan trong thể tích dưới 50 µL

Phương pháp thực nghiệm

Sử dụng ba mẫu DNA plasmid pUC19 (Thermo Scientific, SD0061) đã được chuẩn bị. Mẫu 1 là pUC19 tinh khiết, trong khi mẫu 2 và 3 là pUC19 được thêm vào 150 ppm phenol và 20 mM EDTA tương ứng, nhằm mô phỏng sự tạp nhiễm thường gặp trong quá trình chiết xuất DNA thông thường. Nồng độ, tỷ lệ độ tinh khiết A260/A280 và tỷ lệ độ tinh khiết A260/A230 của cả ba mẫu được xác định bằng cách sử dụng thể tích 2,0 µL mỗi mẫu trên máy quang phổ NanoDrop Lite Plus với loại mẫu dsDNA.

Tác động của chất tạp nhiễm đối với sự phân cắt của enzyme endonuclease được đánh giá thông qua việc cắt cả pUC19 tinh khiết và tạp nhiễm bằng HindIII (Thermo Scientific, ER0501), và ủ trong một tiếng rưỡi ở 37°C. Sau khi ủ, HindIII được bất hoạt bằng cách gia nhiệt ở 80°C trong 20 phút. HindIII có một vị trí cắt trong trình tự pUC19, tạo ra một plasmid mạch thẳng dài 2686 cặp bazơ sau khi cắt (Hình 2).

Điện di gel của các mẫu pUC19 đã cắt được thực hiện với gel agarose 1,2% nhằm đánh giá hiệu quả cắt của enzyme endonuclease và xác nhận rằng chiều dài đoạn dự kiến là 2686 bp đã được hình thành. Nồng độ DNA được nạp vào mỗi giếng tương đương khoảng 20 ng/µL. Các dải trên gel tương ứng với các plasmid đã được cắt bằng dao mổ vô trùng. Gel thừa được loại bỏ khỏi mỗi mẫu để thu được 50 mg phục vụ cho quá trình tách chiết tiếp theo. DNA plasmid được chiết xuất từ ba mẫu gel đã cắt theo hướng dẫn của nhà sản xuất từ Bộ chiết xuất gel nhanh Invitrogen™ PureLink™ Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen, K210012). Hai điều chỉnh nhỏ đã được thực hiện để nâng cao hiệu suất thu hồi:

1) Đun ấm dung dịch đệm rửa giải (elution buffer) đến 65°C trước khi nạp vào cột;

2) ủ dung dịch đệm rửa giải trên cột trong 10 phút trước khi rửa giải.

DNA rửa giải được phân tích về nồng độ và độ tinh khiết bằng máy quang phổ NanoDrop Lite Plus sử dụng loại mẫu dsDNA.

Kết quả

Kết quả về nồng độ và độ tinh khiết của các mẫu pUC19 tinh khiết và có tạp nhiễm được xác định bằng thiết bị NanoDrop Lite Plus được trình bày trong Bảng 1. pUC19 tinh khiết cho thấy nồng độ trung bình là 241,8 ng/µL và tỷ lệ độ tinh khiết nằm trong khoảng mong đợi cho dsDNA. Sự tạp nhiễm phenol đã làm tăng nồng độ lên 358,3 ng/µL do sự hấp thụ bổ sung của phenol ở bước sóng 260nm.

Tỷ lệ độ tinh khiết A260/A230 là 1,76, thấp hơn mức mong đợi do phenol cũng góp phần làm tăng độ hấp thụ tại bước sóng dưới 230nm. Sự có mặt của EDTA dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ A260/A280 và làm giảm đáng kể tỷ lệ A260/A230. Do muối hấp thụ mạnh ở bước sóng dưới 230 nm, sự nhiễm bẩn được thể
hiện trong tỷ lệ A260/A230 là 0,28. Khi tỷ lệ độ tinh khiết nằm ngoài phạm vi cho phép, nồng độ tính được không đạt đủ độ chính xác do ảnh hưởng của chất tạp nhiễm đến khả năng hấp thụ. Mẫu nên được tinh chế thêm bằng phương pháp tách chiết cột hoặc kết tủa để đảm bảo độ chính xác của phép đo nồng độ.

Hình 3 trình bày kết quả điện di gel về hiệu suất cắt của enzyme HindIII trong điều kiện có EDTA và nhiễm phenol. pUC19 chưa được cắt trong cột B vẫn ở dạng siêu xoắn và di chuyển xa hơn trên gel so với pUC19 tuyến tính tương ứng trong cột C. Vị trí của pUC19 tuyến tính nằm ở vị trí dự kiến là 2686 bp liên quan đến bậc thang trong cột A. Nhiễm phenol (cột D) có tác động đến hiệu suất cắt của emzyme nhưng nồng độ phenol cao hơn hoặc dung môi hữu cơ khác có thể ức chế thêm enzyme. Nhiễm EDTA ức chế quá trình cắt của HindIII, như thể hiện qua cột E đối chiếu với dải chưa được cắt trong cột B. Kết quả của quá trình cắt khẳng định tầm quan trọng của việc kiểm tra độ tinh khiết trước khi tiến hành quá trình cắt bằng enzyme endonuclease.

Sau khi thực hiện tách chiết gel cho ba mẫu được cắt bằng HindIII, các mẫu tinh khiết đã được đo lại trên máy quang phổ NanoDrop Lite Plus để xác định nồng độ mẫu, tỷ lệ thu hồi và tỷ lệ tinh khiết. Các kết quả này được trình bày trong Bảng 2. Mẫu pUC19 tinh khiết được rửa bằng dung dịch đệm rửa một lần, trong khi các mẫu bị nhiễm phenol và EDTA được rửa hai lần, dẫn đến việc giảm tỷ lệ DNA thu hồi. Nồng độ trung bình của DNA thu hồi từ tất cả các mẫu là 15,04 ng/µL với tỷ lệ thu hồi đạt tới 89%. Tỷ lệ tinh khiết A260/A280 và A260/A230 của tất cả các mẫu đều nằm trong phạm vi cho phép, ngoại trừ mẫu pUC19 bị nhiễm EDTA. Sự giảm tỷ lệ tinh khiết A260/A230 cho thấy sự tồn tại của muối EDTA hoặc guanidine từ hóa chất tách chiết. Việc kết hợp isopropanol trước khi nạp vào cột tách chiết giúp kết tủa DNA khỏi muối, từ đó tạo ra mẫu DNA tinh khiết.

Kết luận

Quy trình nhân bản phân tử yêu cầu các điểm kiểm tra chất lượng (QC) trước và sau quá trình cắt bằng enzyme endonuclease nhằm giảm thiểu khả năng thất bại của các phản ứng phía sau. Các chất tạp nhiễm như phenol và muối đã được chứng minh là có khả năng ức chế hoặc làm giảm hiệu quả của enzyme endonuclease, điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc thực hiện kiểm tra độ tinh khiết trước khi tiến hành cắt. Sau khi hoàn tất quá trình cắt và tách chiết trên gel, cần kiểm tra lại độ tinh khiết để đảm bảo sự thành công của quá trình gắn kết và chuyển đổi. Sử dụng máy quang phổ NanoDrop Lite Plus, tỷ lệ độ tinh khiết A260/A280 và A260/A230 cung cấp một phương pháp đánh giá nhanh chóng và thuận tiện để thực hiện các bước QC mà không cần pha loãng, đòi hỏi khối lượng lớn DNA đã được tách chiết.

Tài liệu tham khảo

1. Cooper, G. M. (2000). Recombinant DNA. In The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sinauer Associates. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/ NBK9950/

2. Mather, M. W., Keightley, J. A., & Fee, J. A. (1993). Recovery and cloning of genomic DNA fragments from dried agarose gels. Methods in Enzymology, 218, 695–704. https://doi.org/10.1016/0076-6879(93)18052-e

3. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2002). Isolating, Cloning, and Sequencing DNA. In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Garland Science. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26837/

4. Optimizing Restriction Endonuclease Reactions | NEB. Retrieved January 8, 2024, from https://www.neb.com/enus/protocols/2012/12/07/optimizing-restriction-endonuclease-reactions

5. Gel Electrophoresis Applications. Thermo Fisher Scientific. Retrieved December 12, 2023, from https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/ cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/naelectrophoresis-education/na-electrophoresis-applications.html

6. Bates, A. D., & Maxwell, A. (2005). DNA Topology. Oxford University Press.

7. Using NanoDrop One/OneC to determine phenol and protein contaminants in nucleic acids for RT-qPCR quality control. Thermo Fisher Scientific. Retrieved January 29, 2024, from https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Application-Notes/nanodrop-one-phenolprotein-contaminants-rtqpcr- en-tn53472.pdf

8. Tan, S. C., & Yiap, B. C. (2009). DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2009, 574398. https://doi.org/10.1155/2009/574398

9. Green, M. R., & Sambrook, J. (2017). Precipitation of DNA with Isopropanol. Cold Spring Harbor Protocols, 2017(8), pdb.prot093385. https://doi.org/10.1101/pdb.prot093385