Nhận diện tạp chất phenol bằng Acclaro™

Phát hiện protein trong mẫu nucleic acid sử dụng máy đo quang phổ NanoDrop One

Tác giả: Sean Loughrey và Brian Matlock, Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE

Các từ khóa: NanoDrop One, Acclaro Contaminant ID, Chemometrics, Xác nhận tạp chất, DNA, dsDNA, nucleic acid , tạp nhiễm protein, Tỷ lệ độ tinh sạch, Định tính, Định lượng, Phân tích phổ, Máy quang phổ, UV-Vis.

Tóm tắt

Máy quang phổ UV-Vis NanoDrop™ One của Thermo Scientific™ cho phép các nhà nghiên cứu định lượng chính xác mẫu nucleic acid và protein ngay cả khi có sự hiện diện của các tạp chất phổ biến. Được tích hợp công nghệ thông minh Thermo Scientific™ Acclaro™ Sample Intelligence tiên tiến, thiết bị NanoDrop One cung cấp thông tin chi tiết hơn về chất lượng mẫu bằng cách xác định các tạp chất và cung cấp nồng độ mẫu thực tế. Thông tin này giúp các nhà khoa học đưa ra quyết định sáng suốt hơn về cách tiến hành các thí nghiệm tiếp theo và cũng cung cấp thông tin quý giá để khắc phục sự cố trong quá trình tách chiết mẫu. Trong phần này, chúng tôi sẽ mô tả cách tính năng Nhận dạng tạp chất Acclaro phát hiện sự tạp nhiễm protein trong các mẫu nucleic acid.

Giới thiệu

Việc định lượng nucleic acid truyền thống được thực hiện thông qua các phép đo hấp thụ ở bước sóng 260 nm (Hình 1). Kỹ thuật này là phương pháp phổ biến trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử, chủ yếu vì sự đơn giản và dễ dàng mà các nhà khoa học có thể thu được thông tin về nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu nucleic acid . Một yếu tố cần cân nhắc khi sử dụng hấp thụ UV để đánh giá mẫu là nhiều tạp chất từ quy trình tách chiết nucleic acid cũng hấp thụ trong nhiều vùng khác nhau của phổ UV (Hình 2). Sự hấp thụ của các tạp chất trong cùng khoảng UV với nucleic acid có thể ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả định lượng theo hai cách: nó có thể làm tăng giá trị A260, dẫn đến nồng độ không chính xác, và có thể ảnh hưởng đến các tỷ lệ độ tinh sạch. Trong một thời gian dài, các tỷ lệ độ tinh sạch là cách chính mà các nhà nghiên cứu đánh giá sự hiện diện của các tạp chất hấp thụ UV.

Tuy nhiên, việc chỉ dựa vào các tỷ lệ độ tinh sạch không cung cấp một đánh giá đầy đủ về các tạp chất tiềm ẩn trong các mẫu nucleic acid . Việc kết hợp các tỷ lệ độ tinh sạch với dữ liệu phổ đầy đủ sẽ tăng cường khả năng của các nhà nghiên cứu trong việc xác định độ tinh sạch của mẫu nucleic acid và đảm bảo rằng nồng độ chính xác có thể được thu được từ phép đo A260.

Nói chung, các nhà nghiên cứu sẽ xác minh rằng các tỷ lệ độ tinh sạch nằm trong một khoảng chấp nhận được (Bảng 1). Khi các tỷ lệ độ tinh sạch không nằm trong khoảng được chấp nhận, nhà nghiên cứu sẽ phân tích hình ảnh quang phổ của mẫu một cách trực quan hoặc tìm kiếm hỗ trợ kỹ thuật. Cho đến nay, việc phân tích quang phổ của một mẫu chủ yếu mang tính chất định tính, và khả năng xác định các tạp chất cụ thể từ quang phổ phần lớn phụ thuộc vào kinh nghiệm của nhà nghiên cứu.

Công nghệ Acclaro được tích hợp trong máy quang phổ NanoDrop One cung cấp một phương pháp định lượng để xác định tạp chất bằng cách sử dụng cách tiếp cận hóa học để phân tích các thành phần hóa học có trong mẫu. Phần mềm Acclaro sử dụng các thuật toán dựa trên một thư viện quang phổ tham chiếu. Các thuật toán này được áp dụng cho quang phổ mẫu, và phần mềm có thể đưa ra dự đoán về sự hiện diện và danh tính của các tạp chất bằng cách sử dụng các nguyên tắc toán học hóa học. Tính năng nhận diện tạp chất Acclaro có thể phát hiện protein, phenol và muối guanidine trong các mẫu dsDNA và RNA. Máy quang phổ NanoDrop One cảnh báo người dùng về sự hiện diện của một tạp chất trong thời gian thực bằng cách hiển thị biểu tượng nhận diện tạp chất màu vàng (như hiển thị trong Hình 3a) bên cạnh số mẫu. Nhấn vào biểu tượng tạp chất sẽ hiển thị đầy đủ chi tiết phân tích tạp chất Acclaro (Hình 3b). Màn hình này hiển thị quang phổ đã giải cấu trúc, các tạp chất đã được xác định, nồng độ DNA đã hiệu chỉnh và %CV, đại diện cho độ tin cậy trong dự đoán của các thuật toán Acclaro. Trong ghi chú kỹ thuật này, chúng tôi trình bày dữ liệu minh họa cách công nghệ Acclaro phát hiện sự tạp nhiễm protein trong các mẫu nucleic acid.

Tạp nhiễm protein trong mẫu nucleic acid

Protein trong các mẫu nucleic acid có thể ảnh hưởng đến kết quả bằng hai cách: 1) góp phần vào độ hấp thụ tại 260 nm, làm tăng nồng độ của khiết 260/280. Sự giảm tỷ lệ này xảy ra do các dư lượng axit amin như tryptophan, tyrosine, phenylalanine, cũng như các liên kết disulfide của Cystine hấp thụ ánh sáng tại 280 nm (Hình 4). Hầu hết các bộ kit tách chiết nucleic acid đều đảm bảo loại bỏ đủ protein; tuy nhiên, nhiều nhà nghiên cứu mới làm quen với việc tách chiết phenol/chloroform thường gặp phải vấn đề tạp nhiễm protein. Trong quá trình tách chiết này, các nhà nghiên cứu phải tách pha nước ra khỏi pha hữu cơ. Do protein kết tủa tại giao diện giữa hai pha này, nên rất dễ dàng vô tình mang protein từ giao diện vào pha nước khi thực hiện tách chiết nucleic acid , từ đó giới thiệu sự tạp nhiễm protein vào mẫu nucleic acid của họ.

Tỷ lệ 260/280 ban đầu được sử dụng như một cách rất nhạy để phát hiện sự tạp nhiễm DNA trong các mẫu protein (Warburg, 1942). Cộng đồng sinh học phân tử sau đó đã áp dụng tỷ lệ 260/280 như một cách để phát hiện sự tạp nhiễm protein trong các mẫu nucleic acid. Tuy nhiên, tỷ lệ 260/280, như một phương tiện phát hiện sự tạp nhiễm protein trong các mẫu nucleic acid , cũng có những hạn chế. Hệ số hấp thụ của protein rất nhỏ so với của nucleic acid , do đó, cần một lượng lớn protein để ảnh hưởng đến tỷ lệ độ tinh sạch 260/280 (Glasel, 1995, Huberman, 1995, và Manchester, 1995). Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn gặp phải các mẫu nucleic acid có tỷ lệ độ tinh sạch 260/280 thấp. Sự tạp nhiễm protein không chỉ khiến các nhà nghiên cứu nhầm lẫn bằng cách làm tăng kết quả nồng độ nucleic acid , mà còn có thể ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng phiên mã ngược và qPCR ở giai đoạn sau bằng cách ức chế hoặc can thiệp vào các phản ứng enzym. Trong ghi chú kỹ thuật này, chúng tôi chỉ ra cách mà mức độ tạp nhiễm protein ảnh hưởng đến tỷ lệ độ tinh sạch và kết quả định lượng. Chúng tôi cũng cho thấy rằng tính năng nhận diện tạp chất Acclaro của máy quang phổ NanoDrop One có thể xác định chính xác protein là tạp chất và cung cấp kết quả nồng độ nucleic acid chính xác.

Vật liệu và phương pháp

Các dung dịch DNA và protein gốc được chuẩn bị như sau. Dung dịch dsDNA được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch DNA từ tinh trùng cá hồi (Invitrogen™, #15632-011) trong đệm Tris-EDTA (TE) (Fisher BioReagents™, pH 7.6, BP-2474-500). Dung dịch protein gốc được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch albumin huyết thanh bò (BSA, Sigma Aldrich®, #A7284) trong đệm TE. Nồng độ của cả hai dung dịch gốc dsDNA và BSA được xác định trên máy quang phổ NanoDrop One so với mẫu blank TE. Tính toán khối lượng được thực hiện bằng cách sử dụng hệ số 50 ng-cm/µL cho dsDNA và hệ số hấp thụ E1% 6.7 cho BSA. Sau đó, chín hỗn hợp DNA và protein được chuẩn bị bằng cách thêm các lượng khác nhau của dung dịch gốc DNA và protein để tạo ra các hỗn hợp được mô tả trong Bảng 2.

Năm lần lặp lại của mỗi dung dịch từ 1–9 được đo trên thiết bị NanoDrop One so với mẫu blank TE. Mỗi lần lặp lại sử dụng một phần dung dịch 1,5 µL mới của hỗn hợp phù hợp. Phần mềm tính toán nồng độ (đã hiệu chỉnh và chưa hiệu chỉnh) và dữ liệu nhận dạng tạp chất Acclaro, sau đó được sử dụng để tạo ra các tập dữ liệu được trình bày trong Bảng 3:

• Nồng độ trung bình và độ lệch chuẩn (SD) dựa trên nồng độ chưa hiệu chỉnh
• Nồng độ trung bình và SD dựa trên nồng độ đã hiệu chỉnh Acclaro
• Tỷ lệ tinh sạch trung bình cho mỗi hỗn hợp

Nồng độ ban đầu (chưa hiệu chỉnh) so với nồng độ đã hiệu chỉnh bằng Acclaro được so sánh, và kết quả được thảo luận dưới đây. Do các hỗn hợp 1–4 không chứa mức protein đủ cao để kích hoạt tính năng nhận diện của Acclaro, nồng độ DNA đã hiệu chỉnh cho các hỗn hợp từ 1 đến 4 được xác định bằng cách thực hiện phân tích quang phổ Acclaro sử dụng phần mềm Thermo Scientific™ TQ Analyst™.

Kết luận và thảo luận

Bảng 3 trình bày dữ liệu từ Acclaro Contaminant ID cho chín hỗn hợp DNA/protein đã được mô tả trong Bảng 2. Khi mức độ nhiễm protein tăng lên, sự chênh lệch giữa kết quả đã hiệu chỉnh và kết quả ban đầu (chưa hiệu chỉnh) cũng trở nên lớn hơn. Điều này nhấn mạnh rằng protein nhiễm có thể làm tăng kết quả nồng độ A260. Kết quả hiệu chỉnh của Acclaro cho thấy cách thuật toán của phần mềm có thể điều chỉnh định lượng cho các mức độ nhiễm protein này và cung cấp nồng độ DNA chính xác hơn so với giá trị A260 đơn thuần.

Dữ liệu trong Bảng 3 cũng chứng minh rằng mức độ nhiễm protein lớn mới gây ra thay đổi đáng kể trong tỷ lệ tinh sạch 260/280. Các mẫu có lượng protein lên đến khoảng 72% theo khối lượng vẫn duy trì tỷ lệ tinh sạch 260/280 ở mức chấp nhận được. Khi tỷ lệ protein nhiễm tăng từ ~72% lên 98%, tỷ lệ 260/280 giảm dần từ 1.74 xuống 0.89.

Biểu đồ cột trong Hình 5 thể hiện so sánh giữa nồng độ DNA chưa hiệu chỉnh và đã hiệu chỉnh trong điều kiện có các mức độ protein nhiễm khác nhau. Sự hiện diện của protein có thể làm tăng nồng độ ban đầu được báo cáo. Dữ liệu cũng cho thấy khi mức độ nhiễm protein vượt quá ~72% theo khối lượng, Acclaro sẽ gắn cờ mẫu và hiển thị nồng độ đã hiệu chỉnh (Bảng 3). Nồng độ DNA đã hiệu chỉnh nằm trong khoảng ±10% so với kết quả của mẫu kiểm soát chỉ chứa DNA. Hỗn hợp 9, có mức độ nhiễm protein cao nhất, cho thấy sự khác biệt lớn nhất giữa kết quả nồng độ đã hiệu chỉnh và chưa hiệu chỉnh. Tuy nhiên, ngay cả với hỗn hợp bị nhiễm nghiêm trọng này, trong đó protein chiếm hơn 98% khối lượng mẫu, kết quả đã hiệu chỉnh của Acclaro đưa nồng độ DNA của hỗn hợp 9 vào trong khoảng ±10% của nồng độ thực. Các kết quả này có độ tái lập cao với độ lệch chuẩn trung bình dưới 1 ng/µL.

Biểu đồ trong Hình 6 cho thấy sự thay đổi của tỷ lệ tinh sạch khi mức độ nhiễm protein tăng lên. Như mong đợi, khi tỷ lệ protein nhiễm tăng, tỷ lệ tinh sạch 260/280 giảm. Tuy nhiên, như thể hiện trong Hình 6, lượng protein cần phải lớn hơn 75% của mẫu mới làm tỷ lệ 260/280 giảm đáng kể xuống dưới 1.65, là giới hạn dưới thường được chấp nhận cho các thí nghiệm tiếp theo. Mặt khác, tỷ lệ tinh sạch 260/230 giảm đều khi tỷ lệ protein trong hỗn hợp tăng lên.

Tỷ lệ 260/230 có thể là một chỉ số nhạy hơn để phát hiện sự nhiễm bẩn protein. Tuy nhiên, khó khăn khi sử dụng tỷ lệ này để phát hiện protein là nhiều chất tạp nhiễm thông thường khác, như các dung dịch muối đệm, muối guanidine và polysaccharides, cũng có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ này. Do đó, chỉ riêng tỷ lệ 260/230 không thể xác nhận sự có mặt của protein. Tính năng Nhận dạng Chất tạp nhiễm Acclaro trên máy quang phổ NanoDrop One mang lại lợi thế đáng kể cho nhà nghiên cứu bằng cách cung cấp nồng độ DNA đã hiệu chỉnh và xác định các chất tạp nhiễm có trong mẫu nucleic acid.

Kết luận

Các thí nghiệm sử dụng nucleic acid yêu cầu mẫu phải có nồng độ và độ tinh sạch được xác định rõ. Phương pháp UV-Vis để định lượng nucleic acid dựa trên khả năng hấp thụ của các phân tử nucleic acid ở bước sóng 260 nm nhằm xác định nồng độ nucleic acid trong dung dịch. Các tạp chất như protein đồng tinh chế cùng với nucleic acid cũng có thể hấp thụ ánh sáng trong vùng UV, dẫn đến việc ước tính quá cao nồng độ nucleic acid. Truyền thống, các nhà nghiên cứu thường dựa vào tỷ lệ độ tinh sạch làm chỉ báo về sự có mặt của các tạp chất trong mẫu nucleic acid . Khi tỷ lệ độ tinh sạch nằm ngoài phạm vi cho phép, điều này có thể cảnh báo người dùng về sự hiện diện của tạp chất, nhưng không cung cấp thông tin về loại và lượng tạp chất có mặt. Công nghệ Acclaro trong máy quang phổ NanoDrop One cung cấp phương pháp định danh tạp chất dựa trên hóa học phân tích quang phổ UV.

Tính năng này mang lại lợi thế cho các nhà nghiên cứu bằng cách giúp họ 1) xác định loại tạp chất có trong mẫu, 2) xác định mức độ tạp nhiễm, và 3) nhận được nồng độ nucleic acid đã được hiệu chỉnh. Bằng cách sử dụng công nghệ Acclaro, các nhà nghiên cứu giờ đây có thể đưa ra các quyết định sáng suốt về cách khắc phục các quy trình chuẩn bị mẫu để giảm thiểu ô nhiễm và cách tiến hành sử dụng mẫu trong các thí nghiệm tiếp theo.

Trong ghi chú ứng dụng này, chúng tôi trình bày cách tính năng Acclaro Contaminant ID:

• Xác định chính xác protein là tạp chất có trong mẫu nucleic acid.
• Tính toán chính xác lượng ô nhiễm protein có trong mẫu nucleic acid.
• Cung cấp các kết quả nồng độ đã được chỉnh sửa chính xác hơn so với việc chỉ sử dụng độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm.

Ngay cả với mức độ ô nhiễm protein rất cao, các giá trị đã được chỉnh sửa vẫn nằm trong khoảng 10% so với nồng độ nucleic acid thực tế.

Tài liệu tham khảo
1. Warburg, O. and W. Christian. 1942. Isolation and crystallization of Enolase. Z. Biochem. 1942. 310:384-421.
2. Glasel, J.A. 1995. Validity of nucleic acid purities monitored by 260 nm/280 nm absorbance ratios. Biotechniques 18:62–63.
3. Huberman, J.A. 1995. Importance of measuring nucleic acid absorbance at 240 nm as well as at 260 nm and 280 nm. Biotechniques 18:636.
4. Manchester, K.L. 1995. Value of A260/A280 Ratios for the Measurement of Purity of nucleic acid s. Biotechniques 19:208-210.