ID chất gây tạp nhiễm phenol Acclaro

Phát hiện phenol trong mẫu axit nucleic sử dụng máy đo quang phổ NanoDrop One

Tác giả: Sean Loughrey và Brian Matlock, Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE

Từ khóa: NanoDrop One, Acclaro Contaminant ID, Phenol Contamination, Tỷ lệ tinh khiết, Chemometrics, UV-Vis, Máy quang phổ, Phân tích quang phổ, Trí thông minh mẫu, Định lượng DNA

Tóm tắt

Công nghệ Thermo Scientific™ Acclaro™ Sample Intelligence mới được tích hợp trong máy quang phổ UVVis Thermo Scientific™ NanoDrop™ One microvolume cho phép các nhà khoa học định lượng chính xác các mẫu axit nucleic của họ khi có các chất tạp nhiễm phổ biến từ các phương pháp tách chiết axit nucleic. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đo nồng độ DNA khi có các lượng khác nhau của chất tạp nhiễm phenol. Sau đó, chúng tôi so sánh các giá trị nồng độ chưa hiệu chỉnh với các giá trị nồng độ đã hiệu chỉnh Acclaro. Kết quả cho thấy nồng độ DNA đã hiệu chỉnh Acclaro nằm trong khoảng 10% nồng độ của mẫu đối chứng chỉ có DNA. Các kết quả đã hiệu chỉnh Acclaro chứng minh tính hiệu quả của thuật toán phần mềm trong việc xác định chất tạp nhiễm phenol, hiệu chỉnh đúng các giá trị nồng độ DNA và cung cấp kết quả nồng độ chính xác hơn so với giá trị A260 đơn thuần. Thông tin này cho phép các nhà khoa học đưa ra quyết định sáng suốt liên quan đến việc sử dụng mẫu trong các thí nghiệm tiếp theo và cung cấp thông tin có giá trị để khắc phục sự cố khi quá trình tách chiết xảy ra vấn đề.

Giới thiệu

Trong kỷ nguyên công nghệ genomics, việc định lượng axit nucleic là một kỹ thuật thiết yếu được sử dụng trong các phòng thí nghiệm hiện đại. Hầu hết các nghiên cứu sinh học và y sinh tiên tiến đều sử dụng các kỹ thuật và quy trình thí nghiệm liên quan đến các mẫu axit nucleic. Các kỹ thuật PCR, qPCR, giải trình tự thế hệ tiếp theo và nhân bản đòi hỏi các nhà nghiên cứu phải xác định độ tinh khiết của mẫu cũng như các biến số quan trọng khác ảnh hưởng đến các mẫu axit nucleic trước khi sử dụng chúng trong các quy trình tiếp theo. Nồng độ, độ tinh khiết và chất lượng mẫu là các biến số mẫu chính có thể thu được bằng nhiều thiết bị khác nhau có sẵn trên thị trường khoa học sự sống.

Việc định lượng axit nucleic theo truyền thống được thực hiện bằng phép đo độ hấp thụ ở 260 nm. Một điều cần cân nhắc khi đánh giá mẫu bằng độ hấp thụ là các chất tạp nhiễm từ quá trình tách chiết axit nucleic hấp thụ ở nhiều vùng khác nhau của quang phổ UV. Sự hiện diện của bất kỳ chất tạp nhiễm nào trong số các mẫu axit nucleic này có thể ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác của kết quả định lượng.

Xem xét tỷ lệ độ tinh khiết là phương pháp chính được sử dụng để đánh giá sự hiện diện của các chất tạp nhiễm hấp thụ tia UV. Nhìn chung, kĩ thuật viên sẽ xác minh rằng tỷ lệ độ tinh khiết của axit nucleic có nằm trong phạm vi chấp nhận được hay không (Bảng 1). Tuy nhiên, chỉ dựa vào tỷ lệ độ tinh khiết không cung cấp đánh giá đầy đủ về các chất tạp nhiễm tiềm ẩn trong các mẫu axit nucleic (Bảng 1). Tỷ lệ độ tinh khiết được sử dụng kết hợp với dữ liệu phổ toàn phần giúp tăng cường đáng kể khả năng xác định không chỉ độ tinh khiết của mẫu axit nucleic mà còn cả nồng độ chính xác thông qua độ hấp thụ A260. Cho đến nay, phân tích quang phổ của mẫu là một nỗ lực nghiên cứu định tính và khả năng xác định các chất tạp nhiễm cụ thể từ quang phổ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm phân tích của nhà nghiên cứu.

Các phương pháp nghiên cứu định lượng và dữ liệu nghiêm ngặt đã thúc đẩy sự phát triển của công nghệ thông minh mẫu Acclaro trong máy quang phổ NanoDrop One. Công nghệ Acclaro cung cấp một phương pháp định lượng tiên tiến để xác định chất tạp nhiễm bằng cách sử dụng các phương pháp hóa học để phân tích các thành phần hóa học có trong mẫu. Cuối cùng, mục tiêu của công nghệ mới này là giúp các nhà khoa học đưa ra quyết định sáng suốt về việc có nên sử dụng mẫu của họ trong các ứng dụng sinh học phân tử sau đó – vốn đòi hỏi nhiều nhân công, tốn kém hoặc tiêu thụ các mẫu hiếm.

Tính năng Nhận dạng chất tạp nhiễm (ID) Acclaro của NanoDrop One cho phép phát hiện các chất tạp nhiễm protein, phenol và muối guanidine trong hỗn hợp axit nucleic được tách chiết. Máy quang phổ NanoDrop One cảnh báo người dùng về sự hiện diện của chất tạp nhiễm theo thời gian thực bằng cách hiển thị biểu tượng ID chất tạp nhiễm màu vàng (Hình 1A) bên cạnh số mẫu trên màn hình cảm ứng NanoDrop One.

Chạm vào biểu tượng chất tạp nhiễm, phần mềm sẽ hiển thị đầy đủ thông tin chi tiết về phân tích chất gây tạp nhiễm do công nghệ Acclaro cung cấp (Hình 1B). Màn hình hiển thị quang phổ đã giải xoắn, chất gây tạp nhiễm, tỷ lệ độ tinh khiết, nồng độ DNA đã hiệu chỉnh và hệ số biến thiên, biểu thị mức độ tin cậy trong dự đoán của thuật toán Acclaro. Trong lưu ý kỹ thuật này, chúng tôi trình bày dữ liệu thu được bằng tính năng Acclaro Contaminant ID.

Dữ liệu cho thấy công nghệ định lượng chặt chẽ này có thể phát hiện chính xác tình trạng nhiễm phenol trong các mẫu axit nucleic và cung cấp giá trị nồng độ DNA chính xác.
Tình trạng phenol bị tạp nhiễm trong các mẫu axit nucleic

Việc sử dụng phenol để tách protein khỏi axit nucleic đã có lịch sử lâu đời, bắt đầu từ những năm 1950. Mặc dù đã có nhiều quy trình và công thức khác nhau được phát triển trong những năm qua, nhưng kỹ thuật phổ biến nhất được Chomczynski và Sacchi phát triển vào giữa những năm 1980. Kỹ thuật này sử dụng hỗn hợp guanidinium thiocyanate, phenol và chloroform giúp các nhà khoa học thu được RNA có độ tinh khiết cao, chưa bị phân hủy chỉ trong một bước (Chomczynski và Sacchi, 1987, Chomczynski và Sacchi, 2006)1-2. Phương pháp này được dùng làm cơ sở cho việc phát triển nhiều bộ kit tách chiết RNA khác nhau bao gồm bộ kit TRIzol™ (Thermo Fisher Scientific), bộ kit TRI Reagent® (Molecular Research Center, Inc), bộ kit QIAzol® (Qiagen), bộ kit TriPure™ (Sigma-Aldrich), bộ kit TRISure™ (Bioline) và bộ kit RNAzol® (Molecular Research Center). Các bộ kit tách chiết này sử dụng các công thức khác nhau của phenol, guanidium thiocyanate và chloroform để phá vỡ tế bào và làm biến tính protein bao gồm DNase và RNase. Dấu vết của các thuốc thử này có thể được tìm thấy trong các mẫu axit nucleic tinh khiết và có thể ảnh hưởng đến quy trình làm việc tiếp theo.

Quy trình tách chiết sẽ tạo ra hai pha – pha hữu cơ và pha nước (Hình 2). Độ pH của dung dịch tách chiết sẽ quyết định loại axit nucleic nào được tách chiết vào pha nước. Dung dịch có tính axit sẽ ưu tiên tách chiết RNA vào pha nước, trong khi dung dịch kiềm sẽ tách chiết cả DNA và RNA vào pha nước. Các protein biến tính một phần tập trung ở pha trung gian giữa hai pha (Hình 2). Việc tách axit nucleic khỏi protein biến tính đòi hỏi phải loại bỏ pha nước mà không làm xáo trộn pha trung gian (Hình 2). Điều này có thể rất khó khăn, đặc biệt là đối với những người mới làm quen với kỹ thuật tách chiết. Để tránh axit nucleic tinh khiết bị nhiễm protein, phenol hoặc guanidine, việc loại bỏ pha nước đòi hỏi kinh nghiệm và kỹ thuật chính xác (Oswald, 2016, Plank, 2010, Jankovic 2016)3-5. Việc sản phẩm tách chiết axit nucleic bị tạp nhiễm với thuốc thử tách chiết vẫn là một vấn đề phổ biến trong phòng thí nghiệm ngày nay và là chủ đề phổ biến đối với nhóm hỗ trợ kỹ thuật NanoDrop.

Sự tạp nhiễm phenol có thể gây ra những tác động sau đây đến mẫu axit nucleic:

• Phenol có thể làm biến tính protein một cách hiệu quả, do đó ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme cần thiết trong các ứng dụng sau đó
• Phenol có hệ số hấp thụ rất cao ở bước sóng 270 nm, do đó nồng độ mẫu bị ảnh hưởng đáng kể ngay cả khi mẫu bị tạp nhiễm với lượng rất nhỏ.

Tính toán và đánh giá tỷ lệ A260/A280 (260/280) hoặc A260/A230 (260/230) là phương pháp truyền thống để phát hiện sự nhiễm bẩn phenol. Tuy nhiên, đây không phải là phương pháp hiệu quả vì phenol có đỉnh hấp thụ tại 270 nm, và tỷ lệ độ tinh khiết của phenol tinh khiết gần với tỷ lệ quan sát được ở DNA và RNA tinh khiết (Bảng 1). Trong ghi chú kỹ thuật này, chúng tôi cho thấy cách các mức độ nhiễm bẩn phenol khác nhau ảnh hưởng đến tỷ lệ độ tinh khiết 260/280 hoặc 260/230 và kết quả định lượng axit nucleic.

Chúng tôi cũng trình bày cách tính năng Nhận dạng tạp chất Acclaro có thể xác định chính xác tạp chất phenol, trừ đi sự hấp thụ phenol khỏi giá trị đo ban đầu và đưa ra kết quả nồng độ axit nucleic chính xác.

Vật liệu và phương pháp

Các mẫu DNA và phenol được chuẩn bị như sau:

• Chuẩn bị stock dsDNA bằng cách pha loãng dung dịch DNA tinh trùng cá hồi (Invitrogen, #15632-011) trong đệm Tris-EDTA (TE) (Fisher BioReagents, pH 7,6, BP- 2474-500).
• Chuẩn bị stock phenol bằng cách pha loãng một dung dịch đệm bão hòa phenol (Fisher BioReagents, BP-1750) trong đệm TE.

Nồng độ của các mẫu stock được xác định trên máy quang phổ NanoDrop One so với mẫu trắng TE.
Chín hỗn hợp bao gồm DNA và phenol đã được chuẩn bị bằng cách thêm các lượng DNA và phenol khác nhau để tạo ra các hỗn hợp được thể hiện trong Bảng 2.

Năm lần lặp lại của mỗi dung dịch được đo trên thiết bị NanoDrop One so với mẫu TE trắng. Một phần 1,5 µL mới của hỗn hợp thích hợp được sử dụng cho mỗi bản sao. Ứng dụng dsDNA đã tính toán nồng độ (bản gốc-chưa hiệu chỉnh và đã hiệu chỉnh) và cung cấp dữ liệu nhận dạng chất tạp nhiễm, sau đó được sử dụng để tạo ra các tập dữ liệu được trình bày trong Bảng 3 cho:

• Nồng độ trung bình và độ lệch chuẩn (SD) dựa trên nồng độ chưa hiệu chỉnh
• Nồng độ trung bình và SD dựa trên Acclaro-nồng độ đã hiệu chỉnh
• Tỷ lệ tinh khiết trung bình cho mỗi hỗn hợp

Nồng độ chưa hiệu chỉnh so với nồng độ đã hiệu chỉnh Acclaro đã được so sánh và kết quả được thảo luận bên dưới. *Hỗn hợp 1 và 2 không chứa nồng độ phenol đủ cao để kích hoạt kết quả Acclaro, do đó, nồng độ DNA đã hiệu chỉnh cho các hỗn hợp này được xác định bằng cách thực hiện thuật toán phân tích quang phổ Acclaro bằng gói phần mềm Thermo Scientific™ TQ Analyst™.

Kết quả và thảo luận

Bảng 3 trình bày dữ liệu ID chất tạp nhiễm Acclaro thu được cho chín hỗn hợp DNA/phenol được mô tả trong Bảng 2. Lưu ý rằng thành phần phenol được biểu thị bằng phần triệu (ppm). Sự chuyển đổi này là cần thiết vì hệ số hấp thụ mol của phenol lớn hơn nhiều so với hệ số hấp thụ của dsDNA. Ví dụ, dung dịch phenol 0.1% là 1000 ppm. Khi mức phenol tăng từ 37.5 ppm lên 1600 ppm, sự khác biệt giữa các giá trị đã hiệu chỉnh và chưa hiệu chỉnh tăng lên. Điều này chứng minh rõ ràng rằng ngay cả lượng rất nhỏ tạp chất phenol có thể làm tăng kết quả nồng độ A260. Kết quả đã hiệu chỉnh Acclaro chứng minh tính hiệu quả của thuật toán phần mềm trong việc xác định tạp chất phenol, hiệu chỉnh đúng các giá trị nồng độ và cung cấp kết quả nồng độ chính xác hơn so với giá trị A260 đơn thuần.

Biểu đồ thanh thể hiện trong Hình 3 so sánh dữ liệu nồng độ DNA chưa hiệu chỉnh và đã hiệu chỉnh khi có sự hiện diện của các mức độ nhiễm phenol khác nhau. Rõ ràng là sự hiện diện của phenol làm tăng đáng kể giá trị nồng độ. Tính năng Acclaro đánh dấu các mẫu khi mức độ nhiễm phenol lớn hơn ~18,75 ppm, do đó minh họa độ nhạy cao của phần mềm trong việc phát hiện nhiễm phenol. Biểu đồ thanh cũng cho thấy rằng trong mọi trường hợp, nồng độ DNA đã hiệu chỉnh Acclaro đều nằm trong khoảng 10% nồng độ của đối chứng chỉ có DNA. Hơn nữa, kết quả nồng độ có khả năng tái tạo cao ở mức độ nhiễm phenol cao, với độ lệch chuẩn trung bình dưới 5 ng/μL.

Biểu đồ trong Hình 4 minh họa rằng lượng tạp nhiễm phenol tăng có tác động rất nhỏ đến cả tỷ lệ 260/280 và 260/230. Một mẫu DNA bị tạp nhiễm phenol 600 ppm có tỷ lệ 260/280 là 1.71 và tỷ lệ 260/230 là 2.08; các giá trị này nằm trong phạm vi được chấp nhận chung đối với các mẫu axit nucleic tinh khiết. Tuy nhiên, với mức độ tạp nhiễm phenol này, kết quả nồng độ DNA thường chênh lệch gấp phai lần. Kết quả của chúng tôi cho thấy không chỉ nên dựa vào tỷ lệ 260/280 và 260/230 để đánh giá độ tinh khiết của mẫu axit nucleic hoặc phát hiện tạp nhiễm.

Kết luận

Xu hướng phát triển các kỹ thuật genomics phức tạp và yêu cầu cao như qPCR, giải trình tự thế hệ mới, phân tích STR, và PCR kỹ thuật số đòi hỏi phải kiểm soát chất lượng chặt chẽ đối với axit nucleic đầu vào. Những quy trình này yêu cầu nồng độ và độ tinh khiết của mẫu phải được xác định rõ ràng và vượt qua các bước kiểm tra chất lượng.

Đo hấp thụ UV là phương pháp thường dùng để xác định nồng độ axit nucleic trước khi thực hiện các quy trình genomic. Phương pháp này nhanh, đáng tin cậy và là phương pháp duy nhất cung cấp thông tin về độ tinh khiết (phổ, tỷ lệ A260/A280, A260/A230). Tuy nhiên, các chất nhiễm bẩn từ bộ kit tách chiết axit nucleic, như phenol, cũng hấp thụ tia UV ở vùng quang phổ tương tự axit nucleic, dẫn đến sự sai sót trong việc tính toán nồng độ axit nucleic.

Theo truyền thống, các nhà nghiên cứu đã dựa vào tỷ lệ 260/280 và 260/230 như một dấu hiệu cho thấy sự hiện diện của chất tạp nhiễm trong dung dịch axit nucleic. Mặc dù tỷ lệ độ tinh khiết có thể chỉ ra sự hiện diện của một số chất tạp nhiễm, nhưng chúng không cung cấp thông tin chắc chắn về danh tính hoặc định lượng chất tạp nhiễm.

Công nghệ thông minh Acclaro được tích hợp trong máy quang phổ NanoDrop One cung cấp phương pháp tiếp cận hóa học để xác định chất tạp nhiễm bằng cách sử dụng phân tích quang phổ UV. Trong ghi chú ứng dụng này, chúng tôi có thể chứng minh rằng tính năng Nhận dạng chất tạp nhiễm Acclaro:

• Xác định chính xác chất tạp nhiễm phenol có trong mẫu axit nucleic.
• Tính toán chính xác lượng phenol tạp nhiễm.
• Cung cấp các giá trị nồng độ axit nucleic đã hiệu chỉnh chính xác hơn so với việc chỉ sử dụng độ hấp thụ ở 260 nm.

Tài liệu tham khảo

• 1. Chomczynski, P. và Sacchi, N. “Phương pháp đơn bước tách RNA bằng guanidinium thiocyanate-phenolchloroform có tính axit.” Anal. Biochem. 162: 156-159. 1987.
• 2. Chomczynski, P. và Sacchi, N. “Phương pháp đơn bước tách RNA bằng guanidinium thiocyanate-phenolchloroform có tính axit: hơn hai mươi năm sau.” Nature Protocols Vol. 1 No.2: 581-585. 2006.
• 3. Oswald, N. “Cơ bản: Cách thức hoạt động của tách chiết DNA bằng phenol.” BiteSize Bio. Ngày 9 tháng 7 năm 2016. http://bitesizebio.com/384/the-basics-how-phenol-extraction-works
• 4. Plank, J. “Ứng dụng thực tiễn của tách chiết phenol/chloroform.” BiteSize Bio. Ngày 3 tháng 5 năm 2010. http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction
• 5. Jankovic, J. “Tách chiết DNA, RNA và protein bằng acid phenol chloroform: 3 trong 1.” BiteSize Bio. Ngày 23 tháng 11 năm 2016. http://bitesizebio.com/31609/acid-phenol-chloroform-extractio