Phát hiện DNA đậu nành và GMO bằng PCR

Máy quang phổ NanoDrop Eight: Định lượng tách chiết DNA đậu nành để phát hiện GMO

Giới thiệu

Tranh cãi về các sản phẩm tạp hóa có chứa sinh vật biến đổi gen (GMO) đã làm tăng nhu cầu thử nghiệm phân tích trong ngành thực phẩm và đồ uống . GMO hoặc cây trồng chuyển gen có chứa DNA đã được biến đổi thông qua kỹ thuật chuyển gen để đưa vào một đặc điểm mong muốn không có trong tự nhiên của loài.1 Trên thế giới, đậu nành là loại cây trồng chuyển gen phổ biến nhất, trong đó khả năng chịu thuốc diệt cỏ là đặc điểm mong muốn nhất và khả năng kháng sâu bệnh theo sau .Luật hiện hành để quản lý các sản phẩm dựa trên GMO khác nhau giữa các quốc gia, cho thấy nhu cầu về các quy trình thử nghiệm đáng tin cậy trên toàn thế giới. PCR định tính được triển khai trước tiên để sàng lọc sự có mặt hoặc vắng mặt của các yếu tố điều hòa hoạt động thường gặp được sử dụng trong cây trồng chuyển gen (GMO). Sau đó, kĩ thuật PCR định lượng được thực hiện nhằm phát hiện các mục tiêu cụ thể hơn và cung cấp phân tích định lượng về số lượng bản sao mục tiêu. Hoàn thành đánh giá định tính trước khi PCR định lượng giúp tiết kiệm thời gian và tài nguyên bằng cách loại bỏ các mục tiêu được xác định là không có. Trong lưu ý này, một đánh giá định tính đã được thực hiện để xác định sự có mặt hoặc vắng mặt của các yếu tố điều hòa thường gặp.

Sản xuất cây trồng chuyển gen

Các yếu tố điều hòa cấu trúc DNA phổ biến nhất cho phép sản xuất cây trồng chuyển gen là promoter 35S của virus khảm súp lơ (CaMV) (P35S), terminator nopaline synthase Agrobacterium tumefaciens (TNOS) và promoter 34S của virus khảm cây vả (FMV) (P34S). Trình tự promoter gen RNA CaMV 35S được mô tả rõ ràng và có chức năng tạo điều kiện cho phiên mã của transgene mong muốn. Trình tự TNOS chứa vị trí polyadenylation có tác dụng chấm dứt phiên mã. Trình tự khởi động 34S từ FMV cho thấy tỷ lệ tương đồng tương đối cao so với trình tự P35S từ CaMV, đặc biệt là ở các vị trí bắt đầu phiên mã. Các biến thể trong trình tự tăng cường FMV, cùng với vị trí tương đối so với trình tự khởi động, có thể là nhược điểm so với CaMV. Tuy nhiên, thiết kế vectơ khởi động kép với P35S và P34S có lợi thế về mặt biểu hiện hiệu quả của hai gen chuyển so với việc kết hợp một trình tự khởi động trong vectơ bicistronic. Có hai phương pháp phổ biến để sản xuất cây trồng chuyển gen với cấu trúc DNA được chỉ định: bắn phá hạt (Hình 1A) và chuyển đổi thông qua Agrobacterium (Hình 1B). Với phương pháp bắn phá hạt, cấu trúc DNA được liên kết với các hạt được tăng tốc ở vận tốc cao vào mô thực vật hoặc tế bào đến nhân. Cấu trúc DNA được giải phóng khỏi các hạt và tích hợp vào DNA của cây thông qua tái tổ hợp tương đồng. Sau khi bắn phá, các tế bào được chuyển sang môi trường chọn lọc dựa trên tác nhân chọn lọc đã chọn trong cấu trúc DNA và cây tái sinh cho đến khi trở thành cây chuyển gen trưởng thành hoàn chỉnh. Với phương pháp Agrobacterium, Agrobacterium lây nhiễm tự nhiên cho cây và sử dụng plasmid gây khối u (Ti) của chính nó để tích hợp DNA chuyển (T-DNA) vào bộ gen của cây. Khi sản xuất cây chuyển gen, đặc điểm mong muốn được đưa vào plasmid Ti, đưa trở lại Agrobacterium và lây nhiễm cho cây. T-DNA chứa gen chuyển tích hợp vào DNA của cây và các tế bào được chọn lọc và tái sinh như mô tả với phương pháp bắn phá hạt.

Phát hiện GMO qua qPCR

Phát hiện GMO đã trở nên đơn giản hơn thông qua các xét nghiệm qPCR đa kênh, trong đó các mục tiêu là P35S/CaMV, TNOS/A. tumefaciens và P34S/FMV. Vì các yếu tố điều hòa này được tìm thấy tự nhiên trong vi-rút hoặc vi khuẩn tương ứng, nên thường gặp phản ứng dương tính giả với GMO nếu cây đã bị nhiễm tự nhiên. qPCR đa kênh cho phép phát hiện đồng thời các yếu tố điều hòa và vi-rút hoặc vi khuẩn để loại bỏ kết quả dương tính giả.

PCR là một xét nghiệm nhạy cảm đòi hỏi DNA khuôn mẫu phải có một lượng cụ thể và độ tinh khiết tối ưu để đảm bảo phản ứng thành công và có thể tái tạo. Để xác định số lượng và chất lượng của DNA khuôn mẫu, Máy quang phổ UV-Vis Thermo Scientific™ NanoDrop™ Eight Microvolume tính toán nồng độ và xác định chất tạp nhiễm từ tách chiết axit nucleic. Thông qua các thuật toán hóa học, Công nghệ Thermo Scientific™ Acclaro™ Sample Intelligence cung cấp thông tin có giá trị về các chất tạp nhiễm, cải thiện hiệu quả làm sạch mẫu cần thiết (Hình 2). Để đơn giản hóa hơn nữa quá trình xử lý mẫu trước quy trình PCR, thiết bị NanoDrop Eight bao gồm tám bệ mẫu thể tích nhỏ cho các quy trình thông lượng cao.
Các chất ức chế PCR phổ biến là các thuốc thử tách chiết còn sót lại như protein và phenol, được xác định bằng công nghệ Acclaro tích hợp trong phần mềm NanoDrop Eight.

Axit nucleic được tách chiết từ nguồn thực phẫm thường bị tạp nhiễm với nhiều loại protein nếu không tuân thủ đúng kỹ thuật tách chiết. Protein tạp nhiễm thường có khả năng ức chế DNA polymerase trong PCR, làm giảm hiệu quả PCR. Việc xác định chất tạp nhiễm bằng phần mềm NanoDrop Eight cho phép các kĩ thuật viên thực hiện các chỉnh sửa đơn giản đối với các quy trình tách chiết mà không cần phải khắc phục sự cố mở rộng khi quy trình PCR kém hiệu quả.

Quy trình tách chiết DNA bằng CTAB

DNA đậu nành được phân lập từ đậu phụ thương mại, sữa đậu nành, edamame và đậu nành bằng quy trình được chỉnh sửa từ Doyle và Doyle (1987) sử dụng chất tẩy rửa ion cetyltrimethylammonium bromide (CTAB). Một kho đệm tách chiết CTAB được tạo ra bằng cách thêm 1,4 M NaCl và 20 mM EDTA vào đệm CTAB (Promega, MC1411). Đậu nành được ngâm trong H2O qua đêm. 700 µL dung dịch đệm CTAB được thêm vào 200 mg đậu phụ, edamame và đậu nành và 200 µL sữa đậu nành. Các mẫu rắn được nghiền thành bột hai lần thông qua sóng siêu âm trong 30 giây ở biên độ 40% bằng cách sử dụng Branson Sonifier SFX150. Tất cả các mẫu được ủ ở 65°C trong một giờ và được khuấy thường xuyên và ly tâm ở 16.000 x g trong 5 phút. Một thể tích phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) (Invitrogen, 15593031) được thêm vào phần dịch nổi, và mẫu được khuấy cũng như ly tâm ở 16.000 x g trong 5 phút. Lớp nước được xử lý bằng 10 µL RNase A (Thermo Scientific, EN0531) ở 37°C trong 30 phút.
Một lượng thể tích clorofom:isoamyl alcohol (24:1 v/v) (Sigma, 25666) sau đó được thêm vào, xoáy và ly tâm ở 16.000 x g trong 5 phút. Lớp nước được trộn với 2/3 thể tích isopropanol và 0.08 thể tích natri axetat và ủ trong một giờ ở nhiệt độ phòng để kết tủa DNA. Pellet DNA được tạo ra bằng cách ly tâm ở 16.000 x g trong vòng 5 phút và được rửa lại với ethanol 70% lạnh và ly tâm hai lần, loại bỏ phần dịch nổi sau mỗi lần quay. Viên được sấy khô ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hòa tan trong 50 µL Tris-EDTA (TE) pH 8.0. Các mẫu được đo theo bản sao của bốn mẫu bằng chế độ tám kênh trên thiết bị NanoDrop Eight.

qPCR với bộ kit sàng lọc GMO

Kit sàng lọc GMO Thermo Scientific TaqMan được thiết kế để kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt của GMO trong tách chiết DNA từ các mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Bộ kit bao gồm chứng dương, các đoạn mồi và đầu dò cần thiết cho các phản ứng đa mục tiêu: P35S/CaMV, TNOS/A. tumefaciens và P34S/FMV, cũng như một đối chứng thực vật nội sinh và chứng dương bên trong để xác định sự ức chế PCR. Các mẫu DNA từ đậu phụ, sữa đậu nành, edamame và đậu nành được pha loãng thành 20 ng/µL trước khi nạp vào dĩa qPCR. qPCR được thực hiện bằng hệ thống real-time PCR Applied Biosystems™ QuantStudio™ 6 Pro với các điều kiện tuần hoàn được nêu trong quy trình kit sàng lọc GMO TaqMan. Kết quả được phân tích bằng ứng dụng qPCR để phân tích sự có mặt và vắng mặt trên nền tảng Thermo Fisher Connect.

Kết quả

Theo phương pháp tách chiết CTAB, DNA từ đậu phụ, sữa đậu nành, edamame và đậu nành được kiểm tra nồng độ và độ tinh khiết bằng Máy quang phổ NanoDrop Eight (Hình 3). DNA được tách chiết với năng suất cao; tất cả các mẫu đều gần 100 ng/µL. Tất cả các mẫu đều có độ tinh khiết tuyệt đối, được chứng minh bằng tỷ lệ tinh khiết 260/A280 nằm trong khoảng 1.85 và 1.90 và không có bất kỳ cảnh báo nào về công nghệ Acclaro.

Quá trình ủ ở nhiệt độ lạnh trong bước kết tủa isopropanol được phát hiện là có khả năng kết tủa các muối dư thừa; do đó, ủ ở nhiệt độ phòng được khuyến cáo trong bước này. Một số quy trình tách chiết DNA bao gồm xử lý RNase sau khi tái huyền phù DNA trong đệm sau khi kết tủa, do đó cần có bước kết tủa DNA thứ hai.15 Xử lý RNase trong thí nghiệm này được thực hiện giữa các lần tách pha clorofom để loại bỏ các enzyme tạp nhiễm và ngăn ngừa sự hao hụt DNA từ lần kết tủa thứ hai.

Kết luận

Khi sử dụng qPCR để phát hiện GMO, độ tin cậy của dữ liệu là ưu tiên hàng đầu vì các sản phẩm thực phẩm và đồ uống phải tuân thủ các quy định của chính phủ về cây trồng chuyển gen. Việc chuẩn bị DNA để phân tích bằng qPCR đòi hỏi độ tinh khiết tuyệt vời và nồng độ phải được biết rõ. Với máy quang phổ NanoDrop Eight, chất lượng và số lượng DNA của tám mẫu microvolume được xác định đồng thời trong vòng chưa đầy hai mươi giây. Công nghệ Acclaro cung cấp thông tin quan trọng về chất tạp nhiễm mẫu, đảm bảo quy trình tách chiết thành công cho quy trình chạy qPCR phía sau.

Tài liệu tham khảo
1. Rani, S.J., & Usha, R. (2013). Cây trồng chuyển gen: Các loại, lợi ích, lo ngại của công chúng và tương lai. Journal of Pharmacy Research, 6, 879-883.
2. Turnbull C., Lillemo M., và Hvoslef-Eide TAK. (2021). Quy định toàn cầu về cây trồng biến đổi gen trong bối cảnh bùng nổ cây trồng chỉnh sửa gen – Một đánh giá. Front. Plant Sci. 12:630396. doi: 10.3389/fpls.2021.630396.
3. James, Clive. (2011). Tình trạng toàn cầu của các cây trồng công nghệ sinh học/GM thương mại: 2011. ISAAA Brief No. 43. ISAAA: Ithaca, NY.
4. Fraiture, M. A., Herman, P., Taverniers, I., De Loose, M., Deforce, D., & Roosens, N. H. (2015). Các phương pháp hiện đại trong việc phát hiện GMO: thách thức và giải pháp. BioMed Research International, 2015, 392872. https://doi.org/10.1155/2015/392872.
5. Amack, S. C & Antunes, M. S. (2020). Promoter CaMV35S – Một công cụ chủ chốt trong sinh học thực vật và công nghệ sinh học trong thời đại sinh học tổng hợp. Current Plant Biology, 24, 100179. doi: 10.1016/j.cpb.2020.100179.
6. Holden, M. J., Levine, M., Scholdberg, T., Haynes, R. J., & Jenkins, G. R. (2010). Sử dụng các yếu tố biểu hiện 35S và Tnos trong đo lường các vật liệu cây trồng biến đổi gen. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 396(6), 2175–2187. https://doi.org/10.1007/s00216- 009-3186-x.
7. Sanger, M., Daubert, S., & Goodman, R. M. (1990). Đặc điểm của một promoter mạnh từ virus mosaic figwort: so sánh với promoter 35S từ virus mosaic súp lơ và promoter mannopine synthase điều hòa. Plant Molecular Biology, 14(3), 433–443. https://doi.org/10.1007/BF00028779.
8. Bak A. và Emerson JB. (2020). Virus mosaic súp lơ (CaMV): Sinh học, quản lý, và liên quan đến phát hiện cây trồng biến đổi gen trong nông nghiệp hữu cơ bền vững. Front. Sustain. Food Syst. 4:21. doi: 10.3389/fsufs.2020.00021.
9. Kim, K. J., Kim, H. E., Lee, K. H., Han, W., Yi, M. J., Jeong, J., & Oh, B. H. (2004). Vector hai promoter cực kỳ hiệu quả cho việc sản xuất quá mức các phức hợp protein. Protein Science: a publication of the Protein Society, 13(6), 1698–1703. https://doi.org/10.1110/ps.04644504.
10. Homrich, M. S., Wiebke-Strohm, B., Weber, R. L., & BodaneseZanettini, M. H. (2012). Biến đổi gen đậu nành: Một công cụ giá trị cho nghiên cứu chức năng của gen và sản xuất các cây trồng cải thiện về mặt nông nghiệp. Genetics and Molecular Biology, 35(4 (suppl)), 998– 1010. https://doi.org/10.1590/s1415-47572012000600015.
11. Sanford, J.C. (1990). Biến đổi gen thực vật bằng phương pháp biolistic. Physiologia Plantarum, 79: 206-209. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1990.tb05888.x.
12. Yan, Y., Zhu, X., Yu, Y., Li, C., Zhang, Z., Wang, F., Các chiến lược công nghệ nano cho kỹ thuật di truyền thực vật. Adv. Mater. 2022, 34, 2106945. https://doi.org/10.1002/adma.202106945.
13. Lorenz T. C. (2012). Phản ứng chuỗi polymerase: Giao thức cơ bản và các chiến lược giải quyết sự cố và tối ưu hóa. Journal of Visualized Experiments: JoVE, (63), e3998. https://doi.org/10.3791/3998.
14. Rossen, L., Nørskov, P., Holmstrøm, K., & Rasmussen, O. F. (1992). Ức chế PCR bởi các thành phần của mẫu thực phẩm, xét nghiệm chẩn đoán vi sinh vật và các dung dịch chiết DNA. International Journal of Food Microbiology, 17(1), 37–45. https://doi.org/10.1016/0168-1605(92)90017-w.
15. Doyle, J.J. và Doyle, J.L. (1987). Quy trình chiết DNA nhanh cho một lượng nhỏ mô lá tươi. Phytochemical Bulletin, 19, 11-15