Phương pháp tùy chỉnh để định lượng màu của độc tính tế bào

Máy quang phổ NanoDrop

Lactate dehydrogenase (LDH) là một chất đánh dấu độc tính tế bào được giải phóng vào môi trường tế bào khi tính toàn vẹn của màng tế bào giảm.1 Định lượng LDH tế bào chất được giải phóng hữu ích cho nhiều ứng dụng như theo dõi hiệu quả của liệu pháp điều trị ung thư, đánh giá độc tính tế bào của thuốc đang phát triển, thực hiện kiểm soát chất lượng các dòng tế bào trong các cơ sở sản xuất, v.v.2-4 LDH được giải phóng được định lượng thông qua phản ứng enzym được nêu trong Hình 1. LDH xúc tác quá trình chuyển đổi lactate thành pyruvate bằng cách khử NAD+ thành NADH; sau đó, diaphorase sử dụng NADH để khử muối tetrazolium (INT) thành formazan có màu đỏ.5,6 Phản ứng enzyme này cung cấp một phương pháp định lượng màu ở bước sóng 490 nm có thể áp dụng với Máy quang phổ UV-Vis Microvolume NanoDrop TM One/OneC của Thermo Scientific™. Đối với các ứng dụng có thông lượng cao hơn, Máy quang phổ UV-Vis Microvolume 8 kênh NanoDrop'” Eight của Thermo Scientific có khả năng tăng tốc quá trình xử lý mẫu.

Quy trình thử nghiệm

Phương pháp tùy chỉnh NanoDrop

Phương pháp tùy chỉnh đã được tạo trên phần mềm điều khiển PC NanoDrop One/OneC để định lượng sản phẩm màu formazan tạo ra- tỷ lệ thuận với lượng LDH được giải phóng ra khỏi tế bào tổn thương. Phương pháp này sử dụng ánh sáng trong phạm vi khả kiến (350-850 nm) với bước sóng phân tích là 490 nm và hiệu chỉnh đường cơ SỞ được đặt thành 680 nm để loại bỏ yêu cầu tính toán hiệu chỉnh bên ngoài phần mềm.

Hệ số đo sử dụng luôn được mặc định là 1 đơn vị để đảm bảo độ hấp thụ được phần mềm báo cáo không cần sự tính toán bổ sung nào dựa trên Định Luật Beer. Phương pháp này cũng bao gồm việc lựa chọn Độ dài đường dẫn tự động để đảm bảo độ dài đường dẫn tốt nhất được sử dụng tùy thuộc vào cường độ hấp thụ ở bước sóng phân tích để ngăn ngừa tình trạng bão hòa máy dò. Tất cả các mẫu đã chuẩn bị đều được đo trong thể tích 2,0 UL bằng bệ microvolume trên thiết bị NanoDrop One.

Xét nghiệm độc tính tế bào CyQUANT LDH

Kit xét nghiệm độc tính tế bào CyQUANT LDH của Invitrogen (Invitrogen, C20301) được cung cấp các thuốc thử cần thiết để thực hiện xét nghiệm đo màu. Để xác định phạm vi tuyến tính của xét nghiệm và độ pha loãng tối ưu, xét nghiệm được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất với Kiểm soát dương tính LDH 1X thay cho nuôi cấy tế bào động vật có vú. Kiểm soát dương tính LDH 1X được pha loãng theo chuỗi 1:1 từ 10 mg/mL thành 0,625 mg/mL BSA (Bảng 1) và được dùng làm mẫu giải phóng LDH tối đa.

Mẫu giải phóng LDH tự phát sử dụng cùng các pha loãng nối tiếp 1:1 của BSA nhưng không bao gồm chứng dương LDH. Mẫu giải phóng LDH tối đa sử dụng dung dịch ly giải 10X, trong khi mẫu giải phóng LDH tự phát sử dụng nước. Đối chứng tự phát cung cấp thông tin về việc liệu môi trường có chứa huyết thanh có chứa LDH hay không – yếu tố có thể phản ánh không đúng thực tế lượng LDH được giải phóng từ các tế bào. Dung dịch sử dụng để hiệu chỉnh thiết bị NanoDrop bao gồm 50 UL của mỗi thành phần sau: dung dịch ly giải 10X, hỗn hợp phản ứng, dung dịch dừng phản ứng và môi trường nuôi cấy. Việc chuẩn bị dung dịch hiệu chỉnh theo cách này đảm bảo cùng nồng độ các thành phần như trong các mẫu, nhằm đảm bảo thiết bị NanoDrop được hiệu chỉnh đúng cách.

Kết quả

Phổ của sản phẩm formazan được sử dụng để định lượng lượng LDH ngoại bào được thể hiện trong Hình 2, với độ hấp thụ cực đại ở 490 nm. Các phép đo độ hấp thụ ở 490 nm của cả 5 mẫu giải phóng LDH tối đa và tự phát được nêu trong Bảng 2. Các mẫu được đo theo ba lần và các giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của từng mẫu được tính toán cụ thể như dưới đây.

Giá trị giải phóng LDH tự phát gần bằng không, cho thấy lượng LDH liên quan đến huyết thanh thấp. Độ lệch chuẩn cho các mẫu giải phóng LDH tối đa nằm trong khoảng từ 0.009 đến 0.154 mg/mL và từ 0.006 đến 0.014 mg/mL cho các mẫu giải phóng LDH tự phát. Độ lệch chuẩn thấp cho mỗi mẫu cho thấy khả năng tái tạo kết quả cao với Máy quang phổ NanoDrop One. Độ hấp thụ trung bình ở 490 nm được biểu thị trên Hình 3. Độ tuyến tính của dụng cụ và xét nghiệm được xác định xảy ra từ Mẫu 1 đến Mẫu 3, cho thấy số lượng tế bào tối ưu cho xét nghiệm nằm trong phạm vi tuyến tính này. Sau đó, số lượng tế bào tối ưu có thể được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo để nghiên cứu độc tính tế bào do hóa chất và thuốc trung gian bằng cùng phương pháp tùy chỉnh NanoDrop và kit xét nghiệm độc tính tế bào LDH. Trước tiên, việc xác định số lượng tế bào tối ưu là rất quan trọng đối với các thí nghiệm độc tính tế bào thành công, để đảm bảo số lượng tế bào nằm trong phạm vi tuyến tính của xét nghiệm và dụng cụ.

Kết luận

Nghiên cứu độc tính tế bào là một yêu cầu chung trong liệu pháp điều trị ung thư, phát triển thuốc và sản xuất QA/QC. Máy quang phổ NanoDrop One/OneC, Máy quang phổ NanoDrop Eight và Phương pháp tùy chỉnh liên quan của chúng cung cấp một phương pháp đáng tin cậy và có thể tái tạo để đo LDH được giải phóng theo chức năng của độc tính tế bào. Máy quang phổ NanoDrop Eight có thể đo độ hấp thụ của tám mẫu cùng lúc, giúp giảm thời gian dành cho các phòng thí nghiệm có năng suất cao để thử nghiệm độc tính tế bào. Có một xét nghiệm đo màu đơn giản và một máy quang phổ đáng tin cậy như những máy được trình bày ở đây có thể khởi động các thí nghiệm độc tính tế bào chất lượng cao.

Tài liệu tham khảo

• 1. Lash, L. H., Tokarz, J. J., & Pegouske, D. M. (1995). Tính nhạy cảm của các nuôi cấy chính của các tế bào ống gần và ống xa từ thận chuột đối với độc tính do hóa chất gây ra. Độc chất học, 103(2), 85–103. https://doi.org/10.1016/0300-483x(95)03110-2
• 2. Cox, M. J., Mendes, R., Silva, F., Mendes, T. F., Zelaya-Lazo, A., Halwachs, K., Purkal, J. J., Isidro, I. A., Félix, A., Boghaert, E. R., & Brito, C. (2021). Ứng dụng xét nghiệm LDH để đánh giá hiệu quả điều trị của các mô hình khối u ex vivo. Báo cáo khoa học, 11(1), Bài báo 1. https://doi.org/10.1038/s41598-021-97894-0
  3. Shaw, K. T. Y., Utsuki, T., Rogers, J., Yu, Q.-S., Sambamurti, K., Brossi, A., Ge, Y.-W., Lahiri, D. K., & Greig, N. H. (2001). Phenserin điều chỉnh quá trình dịch mã của mRNA protein tiền thân
• ß-amyloid bởi một yếu tố phản ứng với interleukin-1, một mục tiêu để phát triển thuốc. Biên bản của Viện Hàn lâm Khoa học Quốc gia, 98(13), 7605–7610. https://doi.org/10.1073/pnas.131152998
• 4. Li, F., Vijayasankaran, N., Shen, A. (Yijuan), Kiss, R., & Amanullah, A. (2010). Quy trình nuôi cấy tế bào để sản xuất kháng thể đơn dòng. mAbs, 2(5), 466-477. https://doi.org/10.4161/mabs.2.5.12720
• 5. Farhana, A., & Lappin, S. L. (2023). Hóa sinh, Lactate Dehydrogenase. Trong StatPearls. StatPearls Publishing. http://www.ncbi.nlm. nih.gov/books/NBK557536/
• 6. Altman, F. P. (1976). Muối Tetrazolium và formazan. Tiến trình trong Histochemistry và Cytochemistry, 9(3), 1–56. https://doi.org/10.1016/ s0079-6336(76)80015-0